甜菜夜蛾對氯蟲苯甲酰胺抗性的分子機制.pdf

1、昆蟲的魚尼丁受體是鈣離子釋放通道，是雙酰胺類殺蟲劑的主要作用靶標。為了研究昆蟲對雙酰胺類殺蟲劑抗性的分子機制，本研究克隆得到了甜菜夜蛾、棉鈴蟲、二化螟、褐飛虱、灰飛虱和白背飛虱這六種常見農(nóng)業(yè)害蟲的魚尼丁受體基因全長序列，并與相關(guān)昆蟲的魚尼丁受體氨基酸序列進行具體比較分析。本文通過比較本實驗室連續(xù)多年篩選的甜菜夜蛾抗性品系和未接觸過藥劑的室內(nèi)敏感品系中魚尼丁受體基因氨基酸序列的差異，在抗性品系中沒有發(fā)現(xiàn)抗性突變，僅有部分堿基多態(tài)性存在。然

2、后深入研究了該基因mRNA表達水平的差異，發(fā)現(xiàn)該基因在抗性品系的不同發(fā)育階段和不同組織中的相對表達水平均明顯高于敏感品系。最后進一步分析抗、感品系的基因組DNA中魚尼丁受體基因的相對水平差異，從而為研究甜菜夜蛾對氯蟲苯甲酰胺抗性的分子機制提供依據(jù)。
　　1.農(nóng)業(yè)害蟲的魚尼丁受體基因全長cDNA的克隆
　　為了從分子水平研究不同昆蟲對雙酰胺類殺蟲劑敏感性差異的原因，本文主要克隆得到了甜菜夜蛾Spodoptera exigua、

3、棉鈴蟲Helicoverpa armigera、二化螟Chilosuppressalis、褐飛虱Nilaparvata lugens、灰飛虱Laodelphax striatellus和白背飛虱Sogatella furcifera這六種常見農(nóng)業(yè)害蟲的魚尼丁受體基因的全長序列，它們的開放閱讀框在15354-15408bp之間，編碼的氨基酸長度在5118-5136之間，并與其他種類昆蟲具有較高的同源性;通過對比不同種類昆蟲間該基因的氨基酸

4、序列及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域差異，發(fā)現(xiàn)六種昆蟲的魚尼丁受體都有相同的蛋白結(jié)構(gòu)域，且鱗翅目和同翅目昆蟲含有不同的低復(fù)雜區(qū)域（low-complexity region，LCR）。
　　2.甜菜夜蛾抗氯蟲苯甲酰胺品系魚尼丁受體基因突變檢測
　　甜菜夜蛾對氯蟲苯甲酰胺的抗性品系在本實驗室經(jīng)過連續(xù)60代的連續(xù)篩選，其抗性倍數(shù)為244.6倍，達到極高水平抗性。本研究對甜菜夜蛾抗性品系與敏感品系魚尼丁受體mRNA的ORF進行了測序與序列比對，大量

5、單頭甜菜夜蛾的魚尼丁受體序列比對后發(fā)現(xiàn)魚尼丁受體序列中存在大量的核苷酸堿基多態(tài)性，與敏感品系的序列比對后并沒有發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定的靶標突變位點，說明該抗性品系對氯蟲苯甲酰胺的極高水平抗性不是由該靶標突變引起的。
　　3.甜菜夜蛾抗/感品系魚尼丁受體基因的定量分析
　　由于本實驗室的氯蟲苯甲酰胺抗性品系中未發(fā)現(xiàn)抗性突變，本研究通過實時熒光定量PCR對抗性品系與敏感品系間魚尼丁受體基因的表達水平差異進行了分析。在甜菜夜蛾各發(fā)育階段，以及幼

6、蟲各組織中均能檢測到魚尼丁受體的表達，卵、幼蟲和蛹的表達量高于成蟲期的表達量;幼蟲各組織間以體壁中表達量最高，其次是馬氏管，以脂肪體中表達量最低，抗性品系與敏感品系甜菜夜蛾具有相同的表達規(guī)律。抗性品系與敏感品系間魚尼丁受體的表達水平差異顯著，在甜菜夜蛾各發(fā)育階段均是以抗性品系的表達量高于敏感品系，幼蟲各組織中的表達量也是以抗性品系高于敏感品系，尤其是抗性品系體壁中魚尼丁受體的相對表達量是敏感品系幼蟲體壁表達量的2倍。
　　鑒于甜菜

7、夜蛾對氯蟲苯甲酰胺抗性品系魚尼丁受體基因的表達水平高于敏感品系，呈現(xiàn)出2倍的關(guān)系，并且各發(fā)育階段與幼蟲各組織均呈現(xiàn)同樣的關(guān)系，我們對甜菜夜蛾抗性品系與敏感品系間魚尼丁受體基因的相對拷貝數(shù)進行了定量測定。利用魚尼丁受體基因的mRNA序列，分別在該基因的5未端和3未端設(shè)計了2對引物，分別對魚尼丁受體基因的基因組拷貝數(shù)進行定量分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抗性甜菜夜蛾魚尼丁受體基因的相對量剛好是敏感品系的2倍，2對在位置上相距甚遠的引物（5末端和3末端）得