利用酵母雙雜交技術(shù)篩選與hPYGO2相互作用蛋白.pdf

1、Pygopus蛋白最早在果蠅中作為Wg(哺乳動(dòng)物同源蛋白Wnt)信號(hào)通路中的特殊組分被發(fā)現(xiàn)的，由此引發(fā)了對(duì)其功能機(jī)理的研究。令人吃驚的是，在果蠅Wg信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中具有專一功能的Pygopus在小鼠中卻有著雙重功能，在Wnt相關(guān)和Wnt獨(dú)立的通路中均發(fā)揮作用。本文介紹了經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路和現(xiàn)階段對(duì)Pygopus蛋白功能的研究情況，并進(jìn)一步分析了Pygopus蛋白兩個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域在轉(zhuǎn)錄過程中的作用。以hPYGO2△NHD為誘餌蛋白篩選人乳

2、腺文庫(kù)后，我們得到70個(gè)陽(yáng)性克隆。陽(yáng)性克隆測(cè)序并將測(cè)序結(jié)果用BLAST分析，13，5，22，35，陽(yáng)性克隆的氨基酸序列分別與CDC73(cell division cycle 73)、BCL6(B—cell CLL/lymphoma 6)、CDC34(cell division cycle 34homolog)、EEF1G(eukaryotic translation elongation factor 1 gamma)四種蛋白具有高度

3、的同源性。在進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)中，我們成功地構(gòu)建了哺乳動(dòng)物表達(dá)載體p3×Flag—CMV—hpygopusΔNHD，pcDNA3.1—Myc—cdc73和pCMV5—Myc—bcl6三個(gè)融合蛋白在293T細(xì)胞中均有效表達(dá)。其中，通過Co—IP和熒光素報(bào)告酶檢測(cè)實(shí)驗(yàn)證明pcDNA3.1—Myc—cdc73與p3×Flag—CMV—hpygopusΔNHD之間存在相互作用，其他蛋白還需要繼續(xù)驗(yàn)證。 本研究認(rèn)為，篩選出的4個(gè)蛋白在酵母中和h

4、PYGO2△NHD之間存在相互作用。其中，CDC73在人類中為Parafibromin，它是PAF蛋白復(fù)合物中的一個(gè)成員，參與核內(nèi)Wg/Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程；BCL6是一個(gè)轉(zhuǎn)錄抑制子。推測(cè)BCL6蛋白能抑制p53腫瘤抑制因子基因的表達(dá)；CDC34是泛素連接酶家族的一員，這個(gè)蛋白是一個(gè)大的蛋白復(fù)合體的一部分，在泛素化介導(dǎo)的細(xì)胞周期G1調(diào)控子的降解和DNA復(fù)制起始的過程中需要它的參與。EEF1G是真核生物轉(zhuǎn)錄延伸因子，因?yàn)镻YGO2有轉(zhuǎn)錄激活