應用酵母雙雜交技術篩選直藻MBP相互作用蛋白.pdf

1、目的：自從MAR(Matrix Attachment Region)片段分離以來，有關MAR及其功能的研究一直是分子生物學的熱點之一。目前已知MAR具有提高轉基因表達水平等作用，但MAR的作用機制尚不清楚。MAR作為順式作用元件，其作用是和其結合蛋白有關的。但目前對MAR結合蛋白的研究較少，只有少部分MAR結合蛋白被分離出來。前期研究中，已從真核單細胞杜氏鹽藻中篩選出一個MAR結合蛋白(MAR-binding protein，MBP)，

2、該蛋白基因全長1623bp，原核表達及其功能研究證實該蛋白能與MAR結合，蛋白定位于細胞核。本研究中，擬通過構建“誘餌”載體pGBKT-MBP，進而利用酵母雙雜交從杜氏鹽藻cDNA文庫篩選與MBP相互作用的蛋白，探討MBP基因的性質(zhì)及生物學意義。
　　 方法：提取杜氏鹽藻總RNA，根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫MBP基因序列，設計引物，RT-PCR擴增MBP基因全長。將擴增的MBP基因依次插入pMD18-T及pGBKT-7載體，構建酵

3、母雙雜交誘餌載體。將經(jīng)過酶切、測序鑒定正確的pGBKT-MBP載體轉化酵母菌株Y187，檢測誘餌載體毒性及自激活。將通過檢測的Y187菌株(轉化有“誘餌”質(zhì)粒)與AH109菌株(含有文庫質(zhì)粒)進行雜交融合，在缺陷性平板篩選克隆，并通過MEL1基因顯色反應來鑒別陽性克隆。提取酵母陽性克隆文庫質(zhì)粒，與誘餌質(zhì)粒進行一對一回復性雜交，再次確認陽性克隆，并對克隆進行生物信息學分析。
　　 結果：利用RT-PCR技術成功擴增出1623bp片

4、段，將該片段插入pMD18-T及pGBKT-7載體，經(jīng)酶切、測序分析該片段為MBP基因全長。pGBKT-MBP載體轉化酵母菌株Y187，僅在SD/-Trp平板生長，且為白色菌落，而在SD/-Trp/-His、SD/-Trp/-Ade平板均不生長，表明“誘餌”質(zhì)粒無自激活。單菌落過夜搖菌后OD600值大于0.8，表明“誘餌”質(zhì)粒對酵母菌株無毒性。經(jīng)過篩選杜氏鹽藻cDNA文庫，初步篩選出26個克隆，經(jīng)過多次X-α-Gal平板篩選，最終確定7