橋本氏甲狀腺炎中IL-23通過抑制細胞自噬誘導(dǎo)ROS累積的研究.pdf

1、目的:
　　本文旨在探討在橋本氏甲狀腺炎（Hashimoto’s thyroiditis，HT）患者中白細胞介素23（interlukin-23，IL-23）是否參與甲狀腺氧化還原平衡紊亂以及ROS累積，其機制是否與誘導(dǎo)細胞自噬異常有關(guān)。
　　方法:
　　1.采用免疫組織化學法檢測10例HT和10例單純結(jié)節(jié)性甲狀腺腫患者的甲狀腺組織中IL-23、IL-23R表達。
　　2.采用免疫熒光染色技術(shù)觀察經(jīng)不同濃度IFN

2、-γ(250 U/mL、500 U/mL、1000 U/mL)或不同濃度 LPS(0.1μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL)或不同濃度TNF-α(10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL)處理后甲狀腺上皮細胞Nthy-ori3-1中IL-23R的表達變化。
　　3．甲狀腺上皮細胞株Nthy-ori3-1用不同濃度IL-23(0 ng/mL、10 ng/mL、50 ng/mL)單獨處理或用特異性IL-23中和抗體

3、預(yù)處理后再與 IL-23(50 ng/mL)共同處理后，采用免疫熒光以及流式細胞術(shù)檢測甲狀腺上皮細胞內(nèi)ROS水平的變化。
　　4.采用免疫組織化學法檢測橋本甲狀腺炎以及單純結(jié)節(jié)性甲狀腺腫患者的甲狀腺組織中自噬相關(guān)蛋白LC3B、Atg12表達。
　　5． Western blot檢測甲狀腺上皮細胞經(jīng)IL-23(50 ng/mL)單獨處理不同時間(8 min、15 min、30 min、1 h、3 h、6 h、12 h)或50

4、ng/ml IL-23與其特異性中和抗體(1μg/mL)共同作用后自噬相關(guān)蛋白 LC3B、Atg12、p62表達變化。
　　6.采用免疫熒光技術(shù)檢測不同濃度IL-23(0 ng/mL、10 ng/mL、50 ng/mL)處理甲狀腺上皮細胞24 h后p-mTOR表達變化。
　　7. Western blot檢測甲狀腺上皮細胞經(jīng)IL-23(50 ng/mL)處理不同時間(8 min、15 min、30 min、1 h、3 h、6

5、 h、12 h)后AKT、p-AKT以及 mTOR、p-mTOR蛋白表達變化。
　　8.甲狀腺上皮細胞在含有或不含有IL-23特異性中和抗體(1μg/mL)預(yù)處理的培養(yǎng)基中與IL-23(50 ng/mL)處理后，采用western blot檢測p-mTOR以及mTOR蛋白表達變化。
　　9. Western blot檢測甲狀腺上皮細胞Nthy-ori3-1經(jīng)不同濃度雷帕霉素（10 nM、20 nM、50 nM）處理不同時間段

6、（12 h、24 h）后p-mTOR表達水平變化。
　　10. Western blot檢測細胞經(jīng)IL-23(50 ng/mL)與雷帕霉素(10 nM)不同組合處理后自噬相關(guān)蛋白LC3B-II、Atg12以及 p62表達變化。
　　11.采用免疫熒光以及流式細胞術(shù)檢測雷帕霉素的加入對甲狀腺上皮細胞內(nèi)ROS表達水平的影響。
　　12.免疫組化檢測橋本甲狀腺炎以及單純結(jié)節(jié)性甲狀腺腫患者甲狀腺組織中p-AKT、AKT以及p-

7、mTOR、mTOR的表達。
　　結(jié)果:
　　1.橋本氏甲狀腺炎患者甲狀腺組織中IL-23以及IL-23R表達明顯高于正常對照組。
　　2.體外實驗結(jié)果顯示，Nthy-ori3-1經(jīng)IFN-γ(250 U/mL、500 U/mL、1000 U/mL)以及LPS（0.1μg/mL、0.5μg/mL濃度）處理后細胞表面IL-23R的表達量均明顯上調(diào)，但不同濃度TNF-α處理組IL-23R表達水平與對照組無明顯差異。
　

8、　3. Nthy-ori3-1經(jīng)不同濃度IL-23處理后其細胞內(nèi)ROS表達水平明顯增強，IL-23中和抗體的加入減少了IL-23誘導(dǎo)的細胞內(nèi)ROS的增加。
　　4.免疫組化結(jié)果顯示，在橋本氏甲狀腺炎患者的甲狀腺組織中自噬相關(guān)蛋白LC3B、Atg12表達明顯低于正常對照組；體外實驗顯示，甲狀腺上皮細胞經(jīng)IL-23處理后其自噬相關(guān)蛋白LC3B、Atg12表達明顯下調(diào)及p62蛋白表達上調(diào)(P<0.01)；相反，IL-23中和抗體的加入使

9、得自噬相關(guān)蛋白LC3B(P<0.05)、Atg12(P<0.01)表達明顯上調(diào)及p62表達明顯下調(diào)(P<0.01)。
　　5.免疫熒光結(jié)果顯示，IL-23處理甲狀腺上皮細胞后引發(fā)磷酸化mTOR表達水平增加且具有一定濃度依賴性；采用western blot技術(shù)在蛋白水平進一步驗證，結(jié)果顯示Nthy-ori3-1經(jīng)IL-23處理不同時間后AKT以及mTOR的磷酸化水平明顯上調(diào)(P<0.05)，加入IL-23中和抗體后則p-mTOR表達

10、水平明顯下降(P<0.05)。
　　6. Western blot結(jié)果顯示，10 nM雷帕霉素處理甲狀腺上皮細胞24 h時，明顯下調(diào)了mTOR以及p-mTOR水平。
　　7. Western blot結(jié)果顯示，與IL-23單獨處理組相比，雷帕霉素的加入使得自噬相關(guān)蛋白LC3B、Atg12表達明顯上調(diào)及p62蛋白表達明顯下調(diào)；免疫熒光以及流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，與IL-23單獨處理組相比，雷帕霉素的加入明顯下調(diào)了ROS的表達（P<

11、0.01)。
　　8.免疫組化結(jié)果顯示，與健康對照組相比，橋本氏甲狀腺炎患者的甲狀腺上皮細胞中p-AKT以及p-mTOR表達水平明顯上調(diào)，然而在正常對照組以及橋本甲狀腺炎患者中總的AKT以及mTOR表達水平?jīng)]有明顯的差異。
　　結(jié)論：
　　綜上所述，我們的結(jié)果顯示橋本甲狀腺炎患者的甲狀腺上皮細胞中IL-23表達明顯增高；IL-23通過活化AKT/mTOR信號通路抑制甲狀腺上皮細胞自噬活性，自噬的抑制導(dǎo)致ROS水平的累積