擬南芥Athspr突變體的耐熱性分析及Athspr基因的原核表達(dá).pdf

1、本課題組通過啟動(dòng)子誘捕技術(shù)獲得一個(gè)多效突變體，T-DNA的插入造成的基因功能改變使擬南芥植株具有生長發(fā)育遲緩，葉片卷曲，植株矮化，抗逆性降低等特征。通過對(duì)相關(guān)基因的克隆和生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，該基因是一個(gè)全新的，與熱激蛋白相關(guān)的基因，并命名為Athspr(heat shock protein-related in Arabidopsisthaliana)。本研究以擬南芥Athspr突變體作為材料，對(duì)野生型和突變體Athspr的耐熱性進(jìn)行了

2、比較，利用原核表達(dá)技術(shù)和Ni柱親和層析技術(shù)表達(dá)純化出具有序列特異性的融合蛋白。主要研究成果如下：
　　 1.分析比較了不同的熱激脅迫下突變體和野生型的表型差異。在短期熱激脅迫中植株未表現(xiàn)出穩(wěn)定的表型差異。當(dāng)降低預(yù)熱激時(shí)間(90min→10min)時(shí)，突變體表現(xiàn)出更高的致死率：長期的輕微熱激脅迫(30℃)后，擬南芥植株具有不同的表型變化，在MS培養(yǎng)基中，上述條件對(duì)植株具有致死性，而在長期土培熱激脅迫中，植株有穩(wěn)定表型差異，突變體表

3、現(xiàn)出葉片卷曲嚴(yán)重，營養(yǎng)生長階段延長，植株不能進(jìn)入生殖生長等表型。同時(shí)對(duì)種子進(jìn)行了熱激脅迫，與野生型相比突變體萌發(fā)率降低：
　　 2.通過SDS-PAGE凝膠電泳分離ATHSPR蛋白并初步分析熱激條件下ATHSPR蛋白在擬南芥植株中的表達(dá)情況。比較了不同蛋白提取法提取ATHSPR蛋白的優(yōu)劣，最終證明硫酸銨分步沉淀法能較好的提取ATHSPR蛋白。在熱激后，擬南芥植株中ATHSPR蛋白均有表達(dá)，突變體中蛋白表達(dá)量降低；
　　

4、3.通過生物信息學(xué)分析，選擇位于Athspr基因第三個(gè)外顯子的957個(gè)特異性堿基作為外源基因，利用原核表達(dá)，在Trans Rosetta(DE3)中表達(dá)出了具有序列特異性的融合ATHSPR蛋白，并通過Ni Sepharose6 Fast Flow凝膠純化得到了純度較高的蛋白，為研究蛋白的表達(dá)模式和功能奠定了良好的基礎(chǔ)。
　　 以上結(jié)果表明，T-DNA插入引起的插入位點(diǎn)基因功能的改變，導(dǎo)致了突變體熱耐受性的降低。說明Athspr基