不同寄主中RBSDV基因組表達(dá)分析及RBSDV P7-1互作寄主因子篩選.pdf

1、水稻黑條矮縮病毒(Rice black streaked dwarf virus，RBSDV)通過灰飛虱（Laodelphax striatellus）以持久性方式傳播，為水稻黑條矮縮病和玉米粗縮病等的病原。RBSDV基因組由10條dsRNA組成，含有13個(gè)開放閱讀框(Open readingframe，ORF)。RBSDV可侵染水稻、玉米和小麥等植物引起矮縮、葉色深綠等癥狀。目前，RBSDV在不同植物寄主中的表達(dá)是否存在差異以及RBS

2、DV在植物寄主與介體昆蟲中的表達(dá)是否存在差異均不清楚。本研究利用quantitativereal-time PCR(qRT-PCR)技術(shù)分析了RBSDV基因組編碼的13個(gè)基因在水稻、玉米、小麥和介體灰飛虱中的表達(dá)。結(jié)果顯示，在水稻、玉米和小麥中P7-1和P10基因相對(duì)表達(dá)量較高，而P7-2和P8基因相對(duì)表達(dá)量則較低;在灰飛虱中P7-1相對(duì)表達(dá)量最高，P8基因相對(duì)表達(dá)量則最低，表明RBSDV在植物和介體昆蟲中的表達(dá)模式具有相似性。P7-1

3、在植物和介體灰飛虱中的表達(dá)量均較高，可作為病毒檢測(cè)的靶基因。P5-1、P6和P9-1為RBSDV病毒基質(zhì)組分，其在不同寄主中的表達(dá)量不同，病毒有可能通過調(diào)整病毒復(fù)制相關(guān)的病毒基質(zhì)基因的表達(dá)而在不同寄主體內(nèi)復(fù)制。RBSDV侵染水稻后致使其內(nèi)源激素ABA含量升高，且對(duì)8d～24d的RBSDV基因組實(shí)時(shí)表達(dá)分析表明，P7-1在侵染后8d～24d均為較高表達(dá)量，在侵染8d時(shí)基因表達(dá)量顯著高于其他病毒基因的表達(dá)。P7-1在不同寄主中的高表達(dá)水平表

4、明其在RBSDV與寄主的相互作用中起著重要作用，而那些在不同寄主中的差異表達(dá)的病毒基因可能參與病毒與寄主的特異性互作。
　　已有研究表明RBSDV P7-1定位于植物的胞間連絲，在植物和介體昆蟲中可形成管狀結(jié)構(gòu)，可能參與病毒的細(xì)胞間運(yùn)動(dòng)。P7-1還是一個(gè)致病因子，在擬南芥中過量表達(dá)P7-1蛋白導(dǎo)致植物不育。此外，我們對(duì)病毒在不同寄主中的表達(dá)量分析表明，P7-1在植物和介體昆蟲中的表達(dá)量均很高。為分析RBSDV P7-1與灰飛虱的互

5、作機(jī)制，本研究以P7-1為誘餌篩選了灰飛虱cDNA文庫(kù)。首先通過RT-PCR擴(kuò)增獲取RBSDV P7-1基因序列，然后構(gòu)建酵母雙雜交誘餌表達(dá)載體pGBKT7-P7-1，通過順序轉(zhuǎn)化方法篩選灰飛虱cDNA酵母文庫(kù)，篩選獲得陽(yáng)性克隆的cDNA插入片段大小通過PCR進(jìn)行分析，將PCR產(chǎn)物大小大于500bp的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌后進(jìn)行測(cè)序，序列在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast比對(duì)分析。測(cè)序結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，篩到的陽(yáng)性克隆分別編碼15種不同的互作蛋

6、白，包括ATP酶B亞基、40S核糖體蛋白、烯醇化酶、羧酸酯酶和蛋白磷酸酶等。研究結(jié)果為進(jìn)一步分析病毒與介體互作機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
　　為分析P7-1與植物的互作關(guān)系，本研究構(gòu)建了水稻cDNA文庫(kù)，并以RBSDVP7-1為誘餌篩選了水稻中的互作因子。水稻cDNA文庫(kù)的構(gòu)建以日本晴(Nipponbare)為材料，通過同源重組技術(shù)制備三框型cDNA入門文庫(kù)，再通過gateway技術(shù)將入門文庫(kù)轉(zhuǎn)移到雜交載體pGADT7-DEST上，構(gòu)建了水

7、稻酵母雙雜交cDNA文庫(kù)。檢測(cè)結(jié)果表明，文庫(kù)容量為1.3×107cfu，擴(kuò)增文庫(kù)滴度為4.34×109cfu/mL，重組率為大于95％，cDNA插入片段平均長(zhǎng)度大于1kb，均達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)cDNA文庫(kù)的要求。以P7-1蛋白為誘餌篩選水稻cDNA文庫(kù)，獲得28個(gè)陽(yáng)性克隆。經(jīng)序列分析后，共獲得11種在酵母中與P7-1互作的水稻因子，包括半胱氨酸蛋白酶合成前體、超氧化物歧化酶、蛋白酶抑制子、Myb轉(zhuǎn)錄因子、轉(zhuǎn)錄因子IIH亞基和過氧化氫酶等。研究結(jié)果