水稻黑條矮縮病毒(RBSDV)進(jìn)化分析及基因表達(dá)調(diào)控研究.pdf

1、水稻黑條矮縮病毒（Rice black-streaked dwarf virus,RBSDV）是呼腸孤病毒科（Reoviridae）斐濟(jì)病毒屬（Fijivirus）的成員，可引起水稻黑條矮縮病、玉米粗縮病等。RBSDV基因組有10條雙鏈RNA（S1-S10），共編碼13種蛋白，其中S1編碼RNA依賴的RNA聚合酶（RdRp），S10編碼外殼蛋白（CP）；S5，S7，S9是雙順反子，各編碼兩個蛋白。RBSDV基因組5’端有帽子結(jié)構(gòu)，而3’

2、端無poly(A)尾。
　　利用RT-PCR方法克隆了水稻黑條矮縮病毒江蘇玉米分離物的全基因組序列。RBSDV江蘇玉米分離物（RBSDV-JS）基因組中最長的為4501bp，最短的為1801 bp。軟件預(yù)測表明S5，S7，S9也含有兩個開放閱讀框（ORF），其余基因組片段均含有一個ORF，RBSDV-JS基因組的10條片段的大小與蛋白編碼情況與GenBank中的已報道RBSDV信息基本一致。基因組序列一致性分析顯示，RBSDV-J

3、S各基因組片段與GenBank中大部分RBSDV分離物對應(yīng)片段的序列一致率均在94％以上。系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示，各基因組片段呈現(xiàn)單獨進(jìn)化的特征，存在RNA重排現(xiàn)象。綜合基因組序列一致性和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，表明江蘇玉米分離物與湖北玉米分離物和河北小麥分離物的整體親緣關(guān)系較近，而與安徽水稻分離物（AH-MX8）的整體親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。RNA重組分析顯示，RBSDV基因組不同片段的進(jìn)化中RNA重組的作用不同：S1、S2和S4中未發(fā)現(xiàn)RNA重組；S3、S5

4、、S6、S8和S10中存在低頻率重組；S7和S9中存在較高頻率重組，其中S7中尤為顯著。
　　RBSDV的10條雙鏈RNA末端存在保守的序列，5’末端為5-AAGTTTTT，3’末端為CAGCTA（G）T（C/A）T（C）GTC-3；另外在保守序列內(nèi)還存在7-11個反向堿基互補(bǔ)。為研究這些元件對翻譯的調(diào)控作用，將RBSDV基因組的S3和S10的5’非編碼區(qū)（5’UTR）和3’非編碼區(qū)（3’UTR）分別插入到螢火蟲熒光素酶（Fluc

5、）的上下游，通過測定Fluc讀數(shù)分析不同片段對翻譯的調(diào)控。以此載體為基礎(chǔ)，同時構(gòu)建一系列突變體，深入分析RBSDV的5’UTR和3’UTR對翻譯的調(diào)控作用。
　　研究表明：
　?。?）S3，S10的5’UTR對Fluc的翻譯起正調(diào)控作用；其中將S3的5’UTR的1-4位，9-10位，11-12位或9-12位堿基突變，均明顯降低Fluc讀數(shù)；而S10的5’UTR的1-4位，9-12位或15-18位突變，也明顯降低Fluc讀數(shù)，

6、表明S3和S10的5’UTR的細(xì)微突變均明顯影響其對翻譯的正調(diào)控作用；反式競爭實驗初步表明5’UTR可能通過結(jié)合核糖體亞基或翻譯起始因子起作用，屬于一類結(jié)構(gòu)簡單的核糖體內(nèi)部起始位點（IRES）；
　?。?）在5’UTR存在的情況下，3’UTR可抑制5’UTR的正調(diào)控作用；突變實驗表明這種抑制來自于5’和3’末端反向堿基互補(bǔ)。
　　為構(gòu)建RBSDVRdRp介導(dǎo)的體外復(fù)制體系，構(gòu)建MBP融合型原核表達(dá)載體。分別表達(dá)完整的RdRp