黃瓜花葉病毒基因組表達(dá)與寄主microRNA的相關(guān)性研究.pdf

1、近年來，病毒的發(fā)生日益猖獗，其對(duì)社會(huì)和人類造成的危害也不斷加重，在突發(fā)性流行的病毒中，大部分都是(+)RNA病毒。人們對(duì)該類病毒已有一定的認(rèn)識(shí)，它們具有簡(jiǎn)單的分子組成和結(jié)構(gòu)，基因組RNA具有mRNA的功能，直接指導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成。然而，由于目前該類病毒的復(fù)制和致病機(jī)理還不清楚，使得我們對(duì)在面臨病毒爆發(fā)時(shí)常常十分被動(dòng)，對(duì)病害進(jìn)行控制和治療時(shí)也往往束手無策。其中，缺少高效、可靠、靈敏的實(shí)驗(yàn)手段對(duì)病毒基因表達(dá)的時(shí)序變化規(guī)律進(jìn)行全程監(jiān)控，是制約我

2、們深入認(rèn)識(shí)該類病毒的瓶頸之一。
　　 黃瓜花葉病毒(Cucumber mosaic virus，CMV)是目前世界上發(fā)生最普遍和危害最嚴(yán)重的植物病毒，也是在中國(guó)研究最多的植物病毒之一。作為典型的多分體(+)RNA病毒，其具有三條基因組RNA(RNA1、RNA2、RNA3)和兩條亞基因組(RNA4、RNA4A)。在寄主體內(nèi)，負(fù)責(zé)CMV復(fù)制、移動(dòng)、包裝、致病性等的5種必需蛋白的含量，分別由單獨(dú)由一條基因組/亞基因組的表達(dá)量決定。因此

3、，對(duì)不同感染時(shí)期、不同致病條件下、不同寄主組織中病毒各基因組的表達(dá)量變化進(jìn)行監(jiān)測(cè)，探索寄主癥狀的發(fā)生與病毒各基因組的消長(zhǎng)關(guān)系，將為我們認(rèn)識(shí)CMV的復(fù)制和致病機(jī)理，研究環(huán)境、寄主和病毒三者之間的關(guān)系，尋找應(yīng)對(duì)該類病毒的控制和治療方法開創(chuàng)新天地。
　　 microRNAs(miRNAs)是一類廣泛存在于真核生物中、長(zhǎng)度21-24 nt的單鏈小RNA分子。近年來，越來越多的研究表明，miRNAs在植物基因表達(dá)調(diào)控、病毒一寄主的互作過程

4、中起非常重要的作用。然而，由于其分子小，并且某些miRNAs只在特定細(xì)胞、特定內(nèi)外因素誘導(dǎo)下瞬時(shí)表達(dá)，還有些miRNAs的表達(dá)量很低，傳統(tǒng)的核酸分析方法很難做到高靈敏度和高特異性，迫切需要高靈敏度、高特異性和高通量的定性/定量檢測(cè)方法，幫助我們進(jìn)一步深入研究miRNAs的分子和細(xì)胞調(diào)控功能。
　　 隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，新興的實(shí)驗(yàn)方法和手段為上述問題的解決開辟了新途徑。熒光定量PCR和基因芯片是近年來發(fā)展起來的新技術(shù)，基于其在

5、基因定量和定性分析方面高通量、高效率的特點(diǎn)，它們?cè)诜肿由飳W(xué)上的應(yīng)用日益廣泛，在基因表達(dá)、核酸定量分析等方面的重要作用日益顯現(xiàn)。本論文就熒光定量PCR和基因芯片技術(shù)在黃瓜植物病毒基因組RNAs的時(shí)序表達(dá)和寄主miRNAs對(duì)病毒侵染的響應(yīng)研究方面，進(jìn)行了以下工作：
　　 1.在國(guó)際上首次建立了對(duì)多分體(+)RNA病毒的各基因組進(jìn)行絕對(duì)/相對(duì)定量分析的實(shí)驗(yàn)體系。首次利用SYBR Green I熒光定量RT-PCR，確定了CMV病毒粒

6、子中RNA1、RNA2、RNA3和RNA4的絕對(duì)拷貝數(shù)分別為(4.47±0.5)x107、(4.87±0.33)x107、(5.57±0.25)x107、(1.60±0.09)x108和(4.20±0.11)x108 copies/μl，對(duì)應(yīng)其比例為RNAl:2：3：4=1.00:1.17(±0.11):3.58(±0.20):5.81(±0.31)。并利用Northem雜交和Lab-on-a-Chip對(duì)該實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證。與常規(guī)的R

7、NA定量分析體系相比較，熒光定量RT-PCR具有較高的靈敏度和準(zhǔn)確性。此外，以18S rRNA為內(nèi)參照，建立了對(duì)寄主組織中CMV各基因組/亞基因組表達(dá)量的時(shí)序變化進(jìn)行相對(duì)定量分析的實(shí)驗(yàn)體系，分析了致弱/非致弱衛(wèi)星RNA對(duì)輔助病毒各基因組表達(dá)量的影響。初步探討了寄主癥狀的改變與CMV各基因組以及衛(wèi)星RNA表達(dá)量變化之間的關(guān)系。
　　 2.優(yōu)化了熒光定量RT-PCR實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理過程。目前，熒光定量PCR技術(shù)所面臨的最突出問題是實(shí)驗(yàn)數(shù)

8、據(jù)龐大、分析困難，另外定量結(jié)果存在誤差、不夠準(zhǔn)確，主要原因是數(shù)據(jù)處理方法導(dǎo)致的。針對(duì)這些問題，我們拓展了前人的研究，將CF值(calibration factor，熒光信號(hào)與DNA分子之間的相關(guān)系數(shù))的計(jì)算引入最新發(fā)展起來的幾種實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理方法中，用Fo(第0個(gè)循環(huán)的熒光值)代替Ct值，對(duì)5種CMV病毒粒子中各個(gè)基因組RNA用不同方法分別進(jìn)行絕對(duì)定量分析。其中LinReg PCR(線性回歸PCR)方法以操作簡(jiǎn)單、計(jì)算方便、定量結(jié)果準(zhǔn)確顯

9、示出更好的優(yōu)越性。在此基礎(chǔ)上，我們提出了應(yīng)用該方法對(duì)不同基因的含量進(jìn)行絕對(duì)/相對(duì)定量分析的簡(jiǎn)便計(jì)算公式，使得基因間的相對(duì)量比較更加簡(jiǎn)捷方便。
　　 3.設(shè)計(jì)合成了植物miRNAs檢測(cè)和表達(dá)分析芯片，補(bǔ)充了數(shù)據(jù)庫(kù)中番茄miRNAs及其靶標(biāo)mRNAs的序列信息，并分析了不同病毒侵染對(duì)寄主番茄miRNAs表達(dá)的影響。利用植物miRNAs的保守性，根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)中已有物種的UniquemiRNA的序列信息，設(shè)計(jì)合成了植物miRNAs檢測(cè)和表

10、達(dá)分析芯片。應(yīng)用該芯片，在健康、感病的番茄葉組織中共檢測(cè)到25個(gè)家族的105條UIuque miRNA的雜交信號(hào)。與Mock比較，病毒侵染后，共引起番茄89條miRNA發(fā)生了差異性表達(dá)，并且不同病毒對(duì)番茄miRNAs表達(dá)圖譜的影響各異，暗示他們通過不同的方式干擾miRNAs的表達(dá)。據(jù)我們所知，這是目前番茄miRNA對(duì)病毒侵染響應(yīng)的最廣泛的一次分析，將為病毒致病機(jī)理、病毒與寄主互作的研究提供了新的分子信息和理論依據(jù)。
　　 4.首

11、次建立了植物miRNAs莖環(huán)結(jié)構(gòu)熒光定量RT-PCR定量分析體系。根據(jù)芯片雜交結(jié)果，篩選出了與病毒侵染密切相關(guān)的植物miRNAs。然后利用3'-RACE的方法，克隆出部分miRNAs的靶標(biāo)mRNAs序列。最后，借鑒并拓展人類及動(dòng)物組織中miRNAs的研究，針對(duì)miRNAs長(zhǎng)度小的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)了莖環(huán)結(jié)構(gòu)的反轉(zhuǎn)錄引物(stem-loop RT primer)。并以染料代替探針，首次利用熒光定量RT-PCR，特異性的檢測(cè)了病毒侵染對(duì)番茄葉組織中