中國番茄黃化曲葉病毒衛(wèi)星DNA編碼的βC1與番茄寄主因子SISnRKI的互作機(jī)制研究.pdf

1、中國番茄黃曲葉病毒(Tomatoyellow leaf curl China virus，TYLCCNV)是單組份雙生病毒，與其相伴隨的衛(wèi)星betasatellite分子--TYLCCNB是該病毒在自然寄主上引起典型癥狀所必需的。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)TYLCCNB互補(bǔ)鏈上所編碼的唯一的蛋白--βCl是一個(gè)RNA沉默抑制子和癥狀決定因子。為弄清βCl蛋白致病的分子機(jī)理，本論文對(duì)TYLCCNBβCl蛋白與番茄寄主因子的互作進(jìn)行了研究。
　　

2、 以TYLCCNBβCl蛋白為誘餌，利用酵母雙雜交系統(tǒng)(yeast two hybridsystem，Y2H)從番茄cDNA文庫中篩選與βCl蛋白互作的番茄寄主因子。將已構(gòu)建好的誘餌質(zhì)粒pGBKT7-βCl、番茄cDNA和線性化的質(zhì)粒pGADT7-Rec共轉(zhuǎn)化酵母菌株AH109，通過三缺營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基和x-α-gal實(shí)驗(yàn)篩選，并進(jìn)一步通過回轉(zhuǎn)驗(yàn)證，最終確定SlSnRK1蛋白為與TYLCCNBβCl互作的番茄寄主因子。構(gòu)建了雙分子熒光

3、互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)(bimolecular fluorescence complementation，BiFC)的重組質(zhì)粒pβCl-YFPN和pSlSnRK1-YFPC，BiFC證實(shí)SlSnRK1和TYLCCNBβCl可以在煙草表皮細(xì)胞中互作，并且互作主要發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)中。
　　 序列分析表明，番茄SlSnRK1屬于SnRK1復(fù)合體的α亞基，SlSnRK1基因全長為1545 bp，預(yù)測(cè)編碼一個(gè)514 aa(約58，824 kD)的蛋白(Ge

4、nBank登錄號(hào)AAF66639)。通過DNAStar軟件聚類分析發(fā)現(xiàn)番茄SlSnRK1蛋白與本氏煙SnRK1、普通煙NPK5的同源性及擬南芥的AKIN11等都有很高的同源性，分別為95％，87％和78％。進(jìn)一步利用 InterProScan軟件(http：//www.ebi.ac.uk/Tools/InterProScan/)分析了SlSnRK1的保守功能域，結(jié)果表明SlSnRK1蛋白主要含有絲/蘇氨酸激酶結(jié)構(gòu)域(kinase dom

5、ain，KD)；泛素相關(guān)結(jié)構(gòu)域(ubiquitin associated domain，UBA)；自我抑制序列(auto-inhibitorysequence，AIS)和C端與復(fù)合體形成有關(guān)的結(jié)構(gòu)域(C-terminal domain，CTD)。
　　 在煙草表皮細(xì)胞中對(duì)SlSnRK1蛋白的亞細(xì)胞進(jìn)行定位，利用農(nóng)桿菌浸潤法將SlSnRK1的N端融合有GFP的表達(dá)載體pCHF3-GFP-SlSnRK1在本氏煙葉片表皮細(xì)胞中進(jìn)行瞬時(shí)

6、表達(dá)，激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)SlSnRK1融合蛋白定位于煙草表皮細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中。
　　 利用特異性引物，以提取的番茄不同器官的總RNA為模板，通過半定量RT-PCR和real-time RT-PCR測(cè)定了SlSnRK1 mRNA表達(dá)的組織特異性，SlSnRK1的mRNA在花中積累量最高，在葉中次之，而在根和莖中的積累量都較低。此外，以提取的TYLCCNV/TYLCCNB侵染的番茄葉片和接種菌株EHA105的番茄葉片總R

7、NA為模板，通過real-time RT-PCR比較分析了SlSnRK1的mRNA積累量的差異，TYLCCNV在侵染早期能上調(diào)SlSnRK1 mRNA在番茄葉片中的積累，在顯癥期則對(duì)SlSnRK1 mRNA積累量無明顯的影響，而在侵染后期則又下調(diào)了SlSnRK1 mRNA在番茄葉片中的積累。
　　 利用野生型(wild type，WT)本氏煙和轉(zhuǎn)正義(sense)擬南芥SnRK1基因的轉(zhuǎn)基因本氏煙植株進(jìn)行病毒侵染效率測(cè)定，結(jié)果發(fā)

8、現(xiàn)，與WT本氏煙相比，TYLCCNV/TYLCCNB侵染效率在轉(zhuǎn)基因過表達(dá)SnRK1的本氏煙中明顯下降，表明SnRK1可能參與了植物對(duì)病毒的防衛(wèi)反應(yīng)。
　　 構(gòu)建了βCl、SlSnRK1以及SlSnRK1 kinase-dead突變體SlSnRK1K48R的酵母表達(dá)載體，利用snf1缺失突變的酵母菌株△snf1 BY4741進(jìn)行酵母互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證βCl蛋白能否在酵母細(xì)胞內(nèi)抑制SlSnRK1的活性。在△snf1 BY4741酵母菌株

9、中單獨(dú)表達(dá)SlSnRK1或SlSnRK1K48R時(shí)，番茄SlSnRK1蛋白能互補(bǔ)酵母SNF1蛋白的功能，而失去激酶活性的SlSnRK1的kinase-dead突變體SlSnRK1K48R喪失了其互補(bǔ)的功能，但在△snf1 BY4741酵母菌株中共表達(dá)SlSnRK1和βCl蛋白時(shí)，βCl蛋白不能抑制SlSnRK1蛋白的互補(bǔ)活性，說明βCl蛋白不能抑制SlSnRK1的激酶活性。
　　 為了進(jìn)一步了解TYLCCNBβCl與SlSnRK

10、1的互作機(jī)理，對(duì)TYLCCNBβCl和SlSnRK1的激酶結(jié)構(gòu)域區(qū)段(含有激酶結(jié)構(gòu)域和泛素相關(guān)結(jié)構(gòu)域，簡稱SlSnRK1-KD)分別進(jìn)行原核表達(dá)和純化，并用于體外磷酸化試驗(yàn)。結(jié)果證實(shí)SlSnRK1-KD激酶能夠在體外條件下特異性磷酸化GST-βCl，對(duì)TYLCCNBβCl蛋白的氨基酸序列進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，βCl33位的絲氨酸和78位的蘇氨酸很可能是SlSnRK1的磷酸化位點(diǎn)，針對(duì)這兩個(gè)位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)了將兩個(gè)位點(diǎn)分別或同時(shí)突變?yōu)楸彼峄蛱於?/p>

11、酸的6個(gè)點(diǎn)突變。對(duì)上述點(diǎn)突變體蛋白與GST進(jìn)行融合位絲氨酸和78位蘇氨酸進(jìn)行突變都能夠明顯降低突變體的磷酸化水平，其中33位絲氨酸突變后對(duì)磷酸化的影響相對(duì)較大，而78位蘇氨酸突變后對(duì)磷酸化的影響相對(duì)較小，說明33位和78位均為SlSnRK1的磷酸化位點(diǎn)，但33位絲氨酸的磷酸化效率高于78位蘇氨酸。
　　 針對(duì)βCl蛋白的兩個(gè)主要磷酸化位點(diǎn)，構(gòu)建了6個(gè)βCl突變的TYLCCNB突變體侵染性克隆，將突變體及其野生型TYLCCNB侵染