少突膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞中的FGF9可能與ALS小鼠的疾病進(jìn)展密切相關(guān).pdf

1、目的：
　　肌萎縮側(cè)索硬化（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）是一種可以引起腦和脊髓中運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元死亡的神經(jīng)系統(tǒng)疾病,該病可以影響隨意肌并且逐漸導(dǎo)致整個(gè)身體的癱瘓。大多數(shù)ALS病人都是散發(fā)性的，大約5-10％是家族性的。ALS由多種因素引起，包括某些特定基因的突變，其中最多被影響的是超氧化物歧化酶基因（super oxide dismutase， SOD），突變的SOD1基因可以同時(shí)是獲得和丟失功能

2、的突變。有毒的突變已被證明可以改變SOD1的活性，導(dǎo)致高毒性的羥自由基積累。突變的SOD1蛋白不僅聚集在神經(jīng)元中，還在運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元周圍的膠質(zhì)細(xì)胞中聚集。ALS是一個(gè)非細(xì)胞自主性的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，疾病的進(jìn)展特征除了運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元內(nèi)的持續(xù)損傷外，也以星形膠質(zhì)細(xì)胞激活為特征。小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞中錯(cuò)誤折疊的SOD1突變蛋白以及應(yīng)對(duì)神經(jīng)元損傷后的反應(yīng)性激活，可以引起炎癥反應(yīng)進(jìn)而導(dǎo)致毒性因子釋放增加。此外，有研究表明神經(jīng)分泌囊泡和神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的蛋白

3、質(zhì)成分嗜鉻顆粒蛋白可以和突變的SOD1蛋白相互作用。嗜鉻顆粒蛋白有可能作為伴侶樣的蛋白協(xié)助運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞的突變SOD1蛋白的分泌。這個(gè)細(xì)胞外的突變SOD1蛋白可以引起小膠質(zhì)細(xì)胞增生，最終引起神經(jīng)元的死亡。成纖維生長(zhǎng)因子9（fibroblast growth factor9，F(xiàn)GF9）在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)主要表達(dá)在神經(jīng)元，作為膠質(zhì)細(xì)胞激活因子（Glia-activating factor，GAF）以自分泌或旁分泌的方式來(lái)促進(jìn)神經(jīng)元和

4、膠質(zhì)細(xì)胞的分化和存活，有證據(jù)證明FGF9與阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease， AD）、帕金森?。≒arkinson's disease， PD）、重度抑郁癥（major depressive disorder，MDD）等密切相關(guān)，但其在運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病中作用還沒(méi)有被研究，我們之前的研究發(fā)現(xiàn)，在終末期SOD1突變陽(yáng)性和陰性的小鼠的基因芯片中FGF9的表達(dá)大量減少，RT-PCR結(jié)果表明在FGF9在mRNA水平上表達(dá)也大量減少

5、，因此，我們的目的是觀察FGF9在SOD1G93A小鼠終末期有怎樣的變化，評(píng)估其是否對(duì)SOD1轉(zhuǎn)基因小鼠的疾病進(jìn)展起著關(guān)鍵作用，有助于探究ALS疾病機(jī)制，也為ALS的有效治療提供新的可能。
　　方法：
　　首先提取鼠尾DNA篩選出SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠和同窩對(duì)照小鼠（littermate），選擇終末期SOD1G93A小鼠為實(shí)驗(yàn)組,littermate為對(duì)照組，用不同的標(biāo)記物對(duì)其腰髓進(jìn)行免疫熒光染色，觀察兩組小鼠脊髓前角神

6、經(jīng)元丟失和膠質(zhì)細(xì)胞增生的情況；再提取它們的腰髓蛋白進(jìn)行蛋白印跡實(shí)驗(yàn)，測(cè)量FGF9、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)和髓鞘相關(guān)糖蛋白（MAG）
　　的蛋白表達(dá)；最后同時(shí)染色 FGF9和 NeuN,FGF9和 Iba-1,FGF9和 GFAP,FGF9和 NG2， FGF9和 CC1， FGF9和 MBP評(píng)估FGF9在終末期SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠和littermate腰髓前角中的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1子代鼠基因組D

7、NA經(jīng)PCR擴(kuò)增，電泳后應(yīng)用GBOX-HR全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果：位于200-300bp之間的條帶（236bp）為mSOD1的擴(kuò)增產(chǎn)物，此小鼠為SOD1G93A轉(zhuǎn)基因的小鼠。沒(méi)有此條帶的為非 SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠。
　　2我們用免疫熒光技術(shù)測(cè)定了終末期SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠和它的同窩對(duì)照鼠的腰髓前角中神經(jīng)元數(shù)量和膠質(zhì)細(xì)胞增生情況。在終末期，與littermate相比， SOD1G93A鼠腰髓前角中NeuN染色陽(yáng)性

8、的細(xì)胞數(shù)顯著減少（P<0.001），GFAP染色陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)顯著增加（P<0.001），且細(xì)胞突起增多，染色增強(qiáng)，提示星形膠質(zhì)細(xì)胞在SOD1G93A終末小鼠中成激活狀態(tài)，Iba-1染色陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)顯著增加（P<0.001），NG2陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)顯著增加（P<0.001），且結(jié)構(gòu)紊亂、邊界不清，CC1陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)顯著增加(P<0.001)，細(xì)胞形狀不規(guī)則、邊界模糊、欠圓潤(rùn)且有突起，而littermate組CC1陽(yáng)性的細(xì)胞圓形、邊界清晰且無(wú)突

9、起。littermate鼠中MBP染色陽(yáng)性的髓鞘邊緣平滑，染色均一，而SOD1G93A鼠MBP陽(yáng)性的髓鞘結(jié)構(gòu)紊亂，呈串珠樣，粗細(xì)不等，染色深淺不一，髓鞘間邊界不清，欠平滑，提示終末期SOD1陽(yáng)性鼠有脫髓鞘發(fā)生。
　　3在蛋白水平上檢測(cè)了終末期SOD1G93A和littermate小鼠中腰髓中的FGF9的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與 littermate相比， SOD1G93A小鼠FGF9蛋白顯著減少（P<0.001），GFAP顯著增多（P<

10、0.01），MAG表達(dá)量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.1）。
　　4我們?cè)诮K末期SOD1G93A小鼠和littermate的腰髓前角中染色了FGF9，運(yùn)用激光共聚焦技術(shù)觀察到在終末期，與 littermate相比， SOD1G93A小鼠FGF9陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)減少但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.1），但形狀和大小出現(xiàn)異常，對(duì)照組被FGF9染色的細(xì)胞大且飽滿，有少量突起，而突變組被FGF9染色的細(xì)胞小且細(xì)長(zhǎng)，突起較多，呈星形狀。
　　針對(duì)這個(gè)現(xiàn)象

11、，我們分別同時(shí)標(biāo)記FGF9和NeuN， FGF9和GFAP， FGF9和Iba-1，F(xiàn)GF9和NG2，F(xiàn)GF9和CC1，F(xiàn)GF9和MBP。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，littermate中FGF9主要存在于神經(jīng)元中，而在星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、少突細(xì)胞的前體細(xì)胞、成熟的少突膠質(zhì)細(xì)胞胞體和髓鞘中幾乎看不到FGF9的表達(dá)。但在終末期SOD1G93A小鼠中由于神經(jīng)元的大量丟失，F(xiàn)GF9也大量減少，僅殘存少數(shù)與NeuN共定位的FGF9陽(yáng)性細(xì)胞。此外，尚存在大量

12、未與NeuN共定位的FGF9陽(yáng)性細(xì)胞。于是我們?cè)诮K末SOD1陽(yáng)性小鼠脊髓中同時(shí)染色FGF9和GFAP，F(xiàn)GF9和Iba-1，發(fā)現(xiàn)FGF9與GFAP共定位,說(shuō)明終末期SOD1G93A鼠的星形膠質(zhì)細(xì)胞中的FGF9被激活表達(dá)；FGF9并未與Iba-1共定位,說(shuō)明FGF9并不在終末期SOD1G93A鼠的小膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)；分別染色FGF9和NG2， FGF9和CC1， FGF9和MBP，發(fā)現(xiàn)FGF9未在少突膠質(zhì)細(xì)胞前體和成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞的髓鞘中表

13、達(dá)，卻在成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞胞體中大量表達(dá)。
　　結(jié)論：
　　1我們的結(jié)果表明，與同窩非轉(zhuǎn)基因小鼠相比，終末期SOD1G93A小鼠脊髓中的神經(jīng)元大量丟失，小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突細(xì)胞數(shù)量顯著增加，表明終末期SOD1G93A鼠脊髓膠質(zhì)細(xì)胞增生明顯，并且觀察到星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)也發(fā)生了改變，提示這兩種細(xì)胞處于激活狀態(tài)。
　　2我們還發(fā)現(xiàn)雖然位于神經(jīng)元中的FGF9隨神經(jīng)元丟失而減少，但是位于少突膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠

14、質(zhì)細(xì)胞中的FGF9在終末階段大量表達(dá)，推測(cè)FGF9可能與少突膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活狀態(tài)有關(guān)，從而與疾病進(jìn)展密切相關(guān)，膠質(zhì)細(xì)胞中FGF9的大量異常表達(dá)有可能加重運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的死亡。關(guān)于ALS中少突膠質(zhì)細(xì)胞的研究并不多，我們的實(shí)驗(yàn)在膠質(zhì)細(xì)胞增生部分研究了少突膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)及數(shù)量的變化，為研究ALS的病因和治療靶點(diǎn)提供了新的可能。此外，目前尚未有研究將ALS與FGF9聯(lián)系起來(lái)，我們的研究證明了FGF9在正常對(duì)照鼠和終末期SOD1G93A鼠