大鼠少突膠質(zhì)細(xì)胞的分離培養(yǎng)與定向誘導(dǎo)分化.pdf

1、目的：少突膠質(zhì)細(xì)胞(Oligodendrocyte，OL)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的髓鞘形成細(xì)胞，在神經(jīng)元信息的快速傳導(dǎo)以及軸突的功能維持方面起著關(guān)鍵的作用。少突膠質(zhì)細(xì)胞起源于胚胎神經(jīng)管的神經(jīng)上皮細(xì)胞，前腦的少突膠質(zhì)細(xì)胞由內(nèi)側(cè)腦室周圍腦室下區(qū)的祖細(xì)胞分化而來(lái)，是一種終末細(xì)胞不具有分裂能力，其來(lái)源于少突膠質(zhì)細(xì)胞/Ⅱ型星形膠質(zhì)細(xì)胞(oligodendrocyte/type2 astrocyte，O2A)。在胚胎形成的晚期階段這些O2A/OPCs在中樞

2、神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)增值并移行，最終分化成為生成髓鞘的少突膠質(zhì)細(xì)胞。目前認(rèn)為在體外培養(yǎng)的少突膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)歷了幾個(gè)不同的階段，包括增值期的OPCs，其特征為前體細(xì)胞標(biāo)記物如血小板來(lái)源生長(zhǎng)因子(PDGFaR)的表達(dá)，形態(tài)上表現(xiàn)為兩級(jí)或三級(jí)的細(xì)胞；未成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞，表達(dá)能被04抗體特異識(shí)別的多級(jí)形態(tài)的細(xì)胞；以及成熟的髓鞘生成少突膠質(zhì)細(xì)胞，其特征為表達(dá)髓鞘特異蛋白如髓鞘脂堿蛋。用更為簡(jiǎn)單適用的方法分離和純化大量有生物活性的OPCs不僅有助于更好的了解少突

3、膠質(zhì)細(xì)胞的功能、行為及軸突-神經(jīng)元的相互作用，更為髓鞘的修復(fù)研究提供了必不可少的工具。更為重要的是，可將體外培養(yǎng)增值的少突膠質(zhì)系細(xì)胞移植入脫髓鞘的中樞神經(jīng)系統(tǒng)，少突膠質(zhì)細(xì)胞前體通過(guò)移行進(jìn)而產(chǎn)生大量成熟的少突膠質(zhì)細(xì)胞，因此O2A/OPCs移值治療脫髓鞘病已在嘗試中，這些實(shí)驗(yàn)均需要大量不同階段的少突膠質(zhì)細(xì)胞。同時(shí)，少突膠質(zhì)系細(xì)胞的分離和培養(yǎng)會(huì)促進(jìn)少突膠質(zhì)系細(xì)胞在體外的使用，如應(yīng)用于脫髓鞘病變的藥物研究等。
　　本實(shí)驗(yàn)旨在研究少突膠質(zhì)細(xì)

4、胞祖細(xì)胞(oligodendrocyte precursor cells，OPCs)培養(yǎng)及純化方法，并研究不同誘導(dǎo)條件對(duì)大鼠O2A/OPCs分化的影響。
　　方法：
　　1.混合膠質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)：取新生48h以內(nèi)的SD大鼠，冰埋麻醉，取出大腦并沿中線切開(kāi)，去除嗅球、基底核、海馬、腦膜和血管組織，將皮層剪成1mm3的小組織塊，篩網(wǎng)過(guò)濾，移入離心管內(nèi)，加入含有DNaseⅠ儲(chǔ)備液(0.2 mg/ml)和trypsin儲(chǔ)備液(0.2

5、5％)的HBSS中進(jìn)行消化(組織培養(yǎng)箱37℃)，約15min后用DMEM20S停止胰酶消化，離心，種植于75mm玻璃培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，每2-3天換液，培養(yǎng)8-9天
　　2.OPCs分離、純化和增值：以振蕩分離法和差速貼壁法分離純化OPCs；加入促進(jìn)增殖的細(xì)胞因子PDGFα和bFGF，獲得數(shù)量較多的OPCs，采用MTT法檢測(cè)OPCs的活力，通過(guò)A285鑒定，培養(yǎng)細(xì)胞純度在95％以上
　　3.定向誘導(dǎo)分化：更換含血清的培養(yǎng)基和不含血清的

6、化學(xué)條件培養(yǎng)基，倒置相差顯微鏡觀察記錄每天細(xì)胞的形態(tài)變化，分化成熟的少突膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)測(cè)定。
　　結(jié)果：
　　1.在接種后第7-8天，混合膠質(zhì)細(xì)胞鋪滿瓶底，少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞位于星形膠質(zhì)細(xì)胞層之上；
　　2.少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞胞體呈圓形，常有單極或雙極突起，形成克隆球，A2B5標(biāo)記陽(yáng)性，免疫熒光鑒定細(xì)胞純度可達(dá)95％以上；3.生長(zhǎng)因子PDGF和bFGF對(duì)少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞的存活和增殖及其重要

7、。OPCs具有雙向分化的能力，在不同誘導(dǎo)條件下可分化為星型膠質(zhì)細(xì)胞或少突膠質(zhì)細(xì)胞；結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了培養(yǎng)新生大鼠皮層中的少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞的方法簡(jiǎn)單可靠。通過(guò)振蕩分離純化法及結(jié)合少突膠質(zhì)細(xì)胞定向培養(yǎng)基可以培養(yǎng)出高純度的少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞。添加PDGF、bFGF可顯著提高細(xì)胞產(chǎn)量，并使細(xì)胞保持在未成熟階段。OPCs具有雙向分化的潛能，在不同化學(xué)成分的培養(yǎng)基中可定向誘導(dǎo)出高純度的少突膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞，這些細(xì)胞可用于藥物對(duì)于神經(jīng)膠質(zhì)