華勒變性及少突膠質(zhì)前體細(xì)胞和雪旺細(xì)胞移植.pdf

1、脊髓損傷后,在損傷遠(yuǎn)端發(fā)生的軸突裂解以及受損軸突被吞噬的過程稱為華勒氏變性(WD)。脊髓損傷后WD區(qū)域內(nèi)的微環(huán)境的變化將會(huì)影響損傷后的修復(fù)過程。我們第一部分的研究旨在系統(tǒng)地觀察SD大鼠胸8后索切斷后,在急性期(1h),亞急性期(10d)以及慢性期(30d)等不同時(shí)段,脊髓后索內(nèi)主要的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞以及軸突的命運(yùn)。這種后索損傷所導(dǎo)致的WD發(fā)生在脊髓后索內(nèi)兩個(gè)方向相反的功能傳導(dǎo)束上,即下行的皮質(zhì)脊髓束(CST)和上行的背側(cè)上行纖維束(DAT包

2、括薄束和楔束；胸5節(jié)段以上主要為薄束)。我們證明在損傷10d和30d后,星形膠質(zhì)細(xì)胞、激活的小膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的數(shù)目在潰變區(qū)域比假手術(shù)組(sham)及急性損傷組明顯增多。在亞急性及慢性階段,膠質(zhì)細(xì)胞纖維酸性蛋白(GFAP)陽性的星形膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量保持穩(wěn)定,而OX-42陽性的小膠質(zhì)細(xì)胞和ED-1陽性的巨噬細(xì)胞的數(shù)目則在慢性階段顯著下降。在慢性階段,ED-1陽性的巨噬細(xì)胞的數(shù)量在距損傷近端3毫米的無潰變區(qū)域內(nèi)也有顯著上升,與在該區(qū)域發(fā)生的

3、軸突退縮(dieback)現(xiàn)象密切相關(guān)。損傷軸突的遠(yuǎn)端在這兩條方向相反的傳導(dǎo)束內(nèi)均經(jīng)歷了持續(xù)的潰變過程。最后,雖然Olig2陽性的OL的數(shù)量在WD區(qū)域有明顯下降,但這些細(xì)胞的存在提示他們?nèi)钥蓪?duì)脊髓損傷后的內(nèi)源性修復(fù)發(fā)揮作用。
　　 我們知道,脊髓損傷后發(fā)生的一系列的軸突潰變、髓鞘脫失等現(xiàn)象,可導(dǎo)致機(jī)體功能喪失,因此一個(gè)很有前景的治療策略就是移植替代髓鞘形成的細(xì)胞。神經(jīng)系統(tǒng)中存在著兩種髓鞘生成細(xì)胞,一種是在周圍神經(jīng)系統(tǒng)中的雪旺氏細(xì)

4、胞(SCs),另一種是在CNS中的少突膠質(zhì)細(xì)胞(OL)。這兩種髓鞘生成細(xì)胞,都具有一定的損傷后修復(fù)能力,但究竟哪一種更適合在WD區(qū)域內(nèi)移植?移植后能否在WD區(qū)域內(nèi)存活和分化?能否形成再生髓鞘?這些問題目前仍無答案,為了探討這些問題,我們?cè)诘谝徊糠盅芯縒D區(qū)域軸突及細(xì)胞變化的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,在發(fā)生潰變的WD微環(huán)境內(nèi)移植這兩種參與髓鞘形成的細(xì)胞。由于已知成熟的OL可分泌多種髓鞘抑制分子,不利于軸突再生,我們移植的細(xì)胞主要為OL的前體細(xì)胞,即少突

5、膠質(zhì)前體細(xì)胞,oligodendrocytes precursor cells(OPCs),因?yàn)檫@些細(xì)胞表達(dá)較少的抑制分子。同時(shí),我們將OPCs和SCs作了移植后的比較,主要比較了它們移植后的存活狀況、分化以及再生髓鞘等方面的差別。兩種細(xì)胞均取自表達(dá)綠色熒光蛋白(green nuorescent protein,GFP)的轉(zhuǎn)基因SD大鼠(GFP,“green rat”CZ-004,SLC,Shizuoka,Japan),SCs取自坐骨神

6、經(jīng),OPCs由神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)而來。我們證明在移植4周后,這兩種細(xì)胞都能在WD區(qū)域內(nèi)存活,其中平均每張切片上存活的細(xì)胞數(shù)在GFP-SCs組要顯著高于GFP-OPCs組。對(duì)移植后存活的GFP-OPCs分化的結(jié)果觀察,發(fā)現(xiàn)約15％的細(xì)胞繼續(xù)保持OPCs的特性,表現(xiàn)為PDGF-a陽性；約11％左右的細(xì)胞分化成為ccl陽性的成熟的OL,同時(shí)約有29％左右的細(xì)胞分化成GFAP陽性的星形膠質(zhì)細(xì)胞。神經(jīng)纖維絲(neurofilament,NF200)免

7、疫熒光染色發(fā)現(xiàn)GFP-SCs組中許多移植細(xì)胞與宿主軸突之間關(guān)系密切,圍繞在軸突周圍；GFP-OPCs組中雖然也有部分細(xì)胞和宿主軸突關(guān)系密切,但數(shù)量并不多。
　　 以上結(jié)果是否說明GFP-SCs更能適應(yīng)慢性損傷后的環(huán)境?它們?cè)诩毙該p傷后的環(huán)境中能否存活?究竟哪一種細(xì)胞的移植能更好地改善動(dòng)物損傷后的功能?更適合在損傷后移植呢?我們進(jìn)行了第二部分的細(xì)胞移植實(shí)驗(yàn),即利用脊髓半橫斷損傷模型,先將細(xì)胞種植入納米材料SAPNS形成的三維支架,

8、然后再移植入損傷的脊髓,來比較SCs和OPCs在體內(nèi)外與SAPNS混合后的生存狀況,以及在脊髓的損傷位點(diǎn),移植細(xì)胞的存活、分化、遷移和功能改善等方面的差別。我們證實(shí)移植前的、與SAPNS在體外混合培養(yǎng)后的GFP-SCs與GFP-OPCs都存活良好,呈現(xiàn)出典型的SCs和OPCs細(xì)胞形態(tài)；在分化培養(yǎng)液中培養(yǎng)7天后,部分GFP-OPCs在SAPNS內(nèi)分化成GFAP陽性的星形膠質(zhì)細(xì)胞；也有部分GFP-OPCsS分化成Rip陽性的成熟的OL。在細(xì)

9、胞體內(nèi)移植8周后,通過熒光顯微鏡我們觀察到發(fā)出綠色熒光的部位,直接證實(shí)了GFP-SCs和GFP-OPCs可以在急性損傷腔內(nèi)存活；其中GFP-OPCs主要局限于損傷腔內(nèi),雖有少量細(xì)胞能進(jìn)入損傷周圍的宿主內(nèi),但也只停留在損傷邊界處,并無向損傷頭尾遠(yuǎn)端遷移的現(xiàn)象；而GFP-SCs可以向損傷頭尾兩側(cè)遷移,平均可以向頭端遷移1毫米左右,但主要表現(xiàn)為向尾端遷移,平均距離超過2.5毫米；統(tǒng)計(jì)每張切片上存活的移植細(xì)胞數(shù),證實(shí)在GFP-SCs組要明顯高于

10、GFP-OPCs組,p<0.01；體內(nèi)移植GFP-OPCs和SAPNS混合物4周后的分化情況表明:移植4周后,OPCs中約有26％的細(xì)胞仍保持未分化狀態(tài),約29％的細(xì)胞分化成GFAP免疫反應(yīng)陽性的星形膠質(zhì)細(xì)胞,有6％的細(xì)胞分化成Rip免疫反應(yīng)陽性的成熟的OL?？贵wNF200染色顯示移植區(qū)內(nèi)再生的軸突與SCs形成密切的聯(lián)系；PO抗體染色顯示出GFP-SCs移植區(qū)內(nèi)出現(xiàn)大量的再生髓鞘；而移植區(qū)內(nèi)GFP-OPCs也與再生軸突的關(guān)系密切,經(jīng)MB

11、P抗體染色顯示移植的GFP-OPCs也可形成髓鞘；統(tǒng)計(jì)結(jié)果證實(shí),SCs移植組內(nèi)的再生軸突數(shù)目要顯著高于OPCs移植組,p<0.01。
　　 為了了解這兩種細(xì)胞和SAPNS混合后移植后,是否利于損傷動(dòng)物的功能改善,我們通過三種行為學(xué)指標(biāo)進(jìn)行觀察,單純SAPNS移植作為對(duì)照組。(1)前肢不對(duì)稱貼壁實(shí)驗(yàn)(觀察患側(cè)前肢在站立時(shí)的貼壁次數(shù))結(jié)果表明從移植后第2周起,GFP-SCs組與單純SAPNS組相比,動(dòng)物使用患側(cè)前肢貼壁的次數(shù)有顯著增

12、加,p<0.01,并保持至第八周；GFP-OPCs組動(dòng)物使用患側(cè)貼壁的次數(shù)雖然比單純SAPNS組有所增加,但并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；(2)理毛實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,在損傷后4～6周,GFP-SCs組動(dòng)物恢復(fù)較快,與GFP-OPCs組和單純SAPNS組相比,有顯著區(qū)別,p<0.01；到6～7周GFP-OPCs組和單純SAPNS組評(píng)分增加,到第8周時(shí),GFP-OPCs組和GFP-SCs組動(dòng)物己無顯著性差異。(3)“獨(dú)木橋”實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,損傷后4～8周之間,

13、三組動(dòng)物在走“獨(dú)木橋”實(shí)驗(yàn)中,都有一定程度的改善,其中尤以GFP-SCs組動(dòng)物恢復(fù)較好,有多只動(dòng)物能夠穿過獨(dú)木橋,僅有少量滑落,但與GFP-OPCs組和單純SAPNS組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差別；GFP-OPCs組和單純SAPNS組動(dòng)物則恢復(fù)較慢,大部分動(dòng)物表現(xiàn)為穿過困難、前后肢滑落以及身體跌落等。綜合三種行為學(xué)測(cè)試結(jié)果表明GFP-SCs組動(dòng)物前肢功能恢復(fù)較好,GFP-OPCs組動(dòng)物也有一定程度的恢復(fù),但與單純SAPNS組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差別。

14、>　　 結(jié)論:(1)損傷后10d和30d組與sham組以及急性損傷組對(duì)比,星形膠質(zhì)細(xì)胞、激活的小膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞數(shù)目在潰變區(qū)域內(nèi)明顯增多；損傷軸突的遠(yuǎn)端經(jīng)歷了持續(xù)的、緩慢的、潰變過程；雖然Olig2陽性的OL的數(shù)量在WD區(qū)域有明顯下降,這些細(xì)胞仍存在于WD內(nèi)并可能對(duì)內(nèi)源性修復(fù)有益。(2)GFP-SCs和GFP-OPCs單純移植、或與SAPNS混合移植到脊髓損傷后的WD區(qū)域中內(nèi)均能存活；其中GFP-SCs存活細(xì)胞數(shù)更多,p<0.01。

15、(3)存活的OPCs在WD區(qū)域及急性損傷區(qū)域內(nèi)都有部分細(xì)胞保持未分化的狀態(tài)(PDGF-a陽性)；也都有部分OPCs可以分化成GFAP陽性的星形膠質(zhì)細(xì)胞以及ccl陽性或Rip陽性的成熟oL。(4)存活的GFP-SCs和GFP-OPCs在WD區(qū)域及急性損傷區(qū)域內(nèi)都有部分細(xì)胞與宿主軸突間關(guān)系密切。在急性損傷模型中GFP-SCs組內(nèi)的再生軸突數(shù)目要顯著高于GFP-OPCs組,p<0.01。(5)三種行為學(xué)測(cè)試結(jié)果表明GFP-SCs組動(dòng)物前肢功能