miR-294調(diào)控TGF-β1通路抑制老年腎間質(zhì)纖維化機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　腎臟衰老是老年慢性腎臟病的病理學(xué)基礎(chǔ)，而腎間質(zhì)纖維化是腎臟衰老的重要表現(xiàn)。腎間質(zhì)纖維化，以細(xì)胞外基質(zhì)沉積為特征，導(dǎo)致腎臟結(jié)構(gòu)和功能的喪失。防治腎間質(zhì)纖維化是保護(hù)老年腎功能、阻止CKD進(jìn)展的重要手段。前期研究發(fā)現(xiàn)老年大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞外泌的微囊泡(MSC-MV)中miR-294表達(dá)下調(diào)，并且miR-294抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)誘導(dǎo)的人腎小管上皮細(xì)胞（HK-2）細(xì)胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化(EMT)。本研究將進(jìn)一步

2、解析miR-294調(diào)控TGF-β1通路的靶基因，探討miR-294對(duì)老年腎間質(zhì)纖維化的治療作用。
　　方法：
　　(1)過(guò)表達(dá)HK-2中miR-294，并建立TGF-β1誘導(dǎo)HK-2上皮轉(zhuǎn)分化模型，運(yùn)用蛋白印記法(Western Blot)、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和免疫熒光方法檢測(cè)EMT相關(guān)指標(biāo)，驗(yàn)證miR-294干預(yù)腎小管生皮細(xì)胞EMT的作用。利用生物信息學(xué)方法查找miR-294在TGF-β1通路的可能靶基因，

3、并運(yùn)用雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。
　　(2)建立老年小鼠單側(cè)輸尿管梗阻(UUO)小鼠腎臟損傷模型，利用轉(zhuǎn)柒試劑尾靜脈注射miR-294，通過(guò)檢測(cè)腎臟組織病理、腎間質(zhì)纖維化標(biāo)志物差異評(píng)估m(xù)iR-294干預(yù)老年腎間質(zhì)纖維化的療效。
　　結(jié)果：
　　(1)體外實(shí)驗(yàn)：①TGF-β1（10ng/ul）誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞纖維化48小時(shí)后，miR-294mimic/NC-miR(20pm/ul)轉(zhuǎn)染HK-2細(xì)胞24小時(shí)，可見(jiàn)miR-29

4、4+TGF-β1組細(xì)胞內(nèi)miR-294明顯過(guò)表達(dá)（增高248454倍）。②經(jīng)TGF-β1誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞，失去上皮細(xì)胞形態(tài)，呈現(xiàn)為長(zhǎng)梭形的成纖維細(xì)胞形態(tài);轉(zhuǎn)染NC-miR后，細(xì)胞形態(tài)較轉(zhuǎn)染之前無(wú)明顯改變;轉(zhuǎn)染miR-294mimic后，部分細(xì)胞可恢復(fù)正常形態(tài)。③Western Blot顯示轉(zhuǎn)染miR-294后間質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物α-SMA、fibronectin、COL3A1表達(dá)量較TGF-β1組明顯下調(diào)，上皮細(xì)胞標(biāo)記物E-cadheri

5、n較TGF-β1組有所增加;免疫熒光顯示TGF-β1組EMT標(biāo)志物α-SMA表達(dá)量較空白組明顯上升，轉(zhuǎn)染miR-294后纖維化α-SMA表達(dá)量明顯下調(diào)。④利用生物信息學(xué)分析miR-294的可能靶基因?yàn)镽BL1;雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)顯示共轉(zhuǎn)染miR-294mimic后,pGL3-WT-RBL1的熒光素酶活性明顯下降(P＜0.05)，但對(duì)pGL3-Mut-RBL1的熒光素酶活性影響不明顯;共轉(zhuǎn)染后對(duì)NC組pGL3-WT-RBL1的熒光素酶

6、活性無(wú)影響;Western Blot顯示TGF-β1誘導(dǎo)EMT后細(xì)胞內(nèi)RBL1表達(dá)明顯增高。
　　(2)體內(nèi)試驗(yàn)：①成功構(gòu)建UUO老年小鼠腎損傷模型。②RT-PCR顯示與sham組及同一時(shí)間點(diǎn)的UUO組相比較，注入miR-294過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)染復(fù)合物后7天、14天小鼠腎組織miR-294的表達(dá)量明顯增高。③與同一時(shí)間點(diǎn)的UUO組比較,miR-294組靶基因RBL1的蛋白表達(dá)量明顯下調(diào);α-SMA、fibronectin的表達(dá)量明顯下降;