miR-21調(diào)控TGF-β通路促進增生性瘢痕形成的機制研究.pdf

1、目的：
　　創(chuàng)傷后增生性瘢痕（HS）是困擾臨床的關(guān)鍵問題之一，其本質(zhì)是一種纖維化疾病。但具體調(diào)控機制不詳。通過對多種纖維化疾病的研究發(fā)現(xiàn)，miR-21在轉(zhuǎn)錄后水平通過調(diào)控TGF-β和Smad7基因的表達，對纖維化的發(fā)生起促進作用。在前期研究中，我們發(fā)現(xiàn) HS組織中 miR-21表達顯著升高，并在預實驗中觀察到 TGF-β促進miR-21的表達。我們推測“皮膚創(chuàng)傷愈合后局部miR-21表達升高，促進了TGF-β的表達，而TGF-β進

2、一步加強了miR-21對瘢痕形成的促進作用，從而形成正反饋，導致HS的形成”是瘢痕增生的新機制。為證實這一假說，我們擬以成纖維細胞（正常皮膚和HS組織）和瘢痕模型為研究對象，應(yīng)用real-time PCR、細胞轉(zhuǎn)染、anti-miR、免疫組化等技術(shù)，從細胞（體外）-組織（體內(nèi)）層次證明我們的假說。此研究有望深入闡明miR-21在HS形成中的作用及機制，并為HS的生物學防治提供新靶點。
　　方法：
　　1、包括臨床患者正常皮膚

3、及HS標本收集；組織石蠟包埋，切片進行HE染色、馬森三色染色和免疫組化染色；組織進行膠原定量檢測；real-time PCR檢測人正常皮膚組織及臨床HS組織中miR-21 mRNA表達水平差異；
　　2、進行人正常皮膚成纖維細胞和 HS成纖維細胞的培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染；構(gòu)建 miR-21過表達和反義干擾載體，定量PCR、WB檢測COLI、COL III、Fibronectin（FN）及α-SMA，從而觀察miR-21對成纖維細胞生物學特性的

4、影響。
　　3、轉(zhuǎn)染mimic-miR-21或anti-miR-21，同時加入TGF-β1或TGF-β1受體抑制劑，定量PCR、ELISA檢測TGF-β1及瘢痕相關(guān)蛋白的表達；從而明確miR-21影響瘢痕形成是否與TGF-β通路有關(guān)；
　　4、通過多個生物信息學網(wǎng)站和軟件（Targetscan, PicTar, miRanda及MicroInspector），對miR-21的靶基因進行預測，篩選與瘢痕形成、肌成纖維分化等功能

5、相關(guān)的特定靶基因；使用 miR-21過表達載體及反義表達載體，分別轉(zhuǎn)染人正常皮膚成纖維細胞和 HS成纖維細胞，采用 qRT-PCR、Western-Blot觀察miR-21對特定靶基因表達的調(diào)控作用；
　　結(jié)果：
　　增生性瘢痕中膠原的含量高于正常皮膚；細胞外基質(zhì)如 COLI、COL III、Fibronectin（FN）及α-SMA在瘢痕中的表達量高；HS組織中miR-21表達明顯升高，瘢痕成纖維細胞轉(zhuǎn)染anti-miR-

6、21可明顯減少瘢痕相關(guān)基因的表達（FN， collagen，α-SMA）；HS組織中高表達的TGF-β1，可以促進成纖維細胞增殖，并促進其合成膠原等ECM；TGF-β增強HS組織的成纖維細胞中mir-21的表達，而抑制mir-21后，TGF-β的促纖維化活性降低；MIR-21抑制其靶基因Smad7的表達；
　　結(jié)論：
　　1、與正常皮膚相比較，增生性瘢痕（HS）中有miR-21的高表達；
　　2、miR-21通過在轉(zhuǎn)錄