鱟抗內(nèi)毒素因子模擬肽設(shè)計(jì)合成及生物活性研究.pdf

1、膿毒癥(sepsis)和膿毒性休克是導(dǎo)致危重病患者死亡的主要原因之一，據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球每年因膿毒癥死亡的病人高達(dá)100萬(wàn)以上，病死率高達(dá)40-60％。 內(nèi)毒素(Lipopolysaccharide，LPS)是引起膿毒癥的主要啟動(dòng)子。LPS通過血漿LPS結(jié)合蛋白(LBP)轉(zhuǎn)運(yùn)，與單核/巨噬細(xì)胞膜上的受體CD14結(jié)合，形成LPS-CD14復(fù)合物后再與跨膜受體TLRs結(jié)合，將外源信號(hào)轉(zhuǎn)入胞內(nèi)，導(dǎo)致單核/巨噬細(xì)胞活化，釋放TNF-α、IL-

2、6等細(xì)胞因子，介導(dǎo)膿毒癥的發(fā)生。在膿毒癥患者中，LPS的檢出率、檢出水平均與病情及預(yù)后密切相關(guān)。因此，封閉LPS的活性是從源頭上防治內(nèi)毒素血癥的關(guān)鍵。 國(guó)內(nèi)外針對(duì)內(nèi)毒素血癥的防治策略目前主要有抑制LPS的合成、阻斷LPS與其受體的結(jié)合、阻斷LPS的胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、抗細(xì)胞因子療法、糖皮質(zhì)激素治療等措施，但均收效甚微。多粘菌素B(PMB)雖能有效中和LPS，但其嚴(yán)重的毒副作用又限制了其臨床應(yīng)用。其他抗菌抗LPS蛋白，如殺菌性/通透性增

3、加蛋白、鱟抗內(nèi)毒素因子及其衍化多肽和一些天然抗菌抗內(nèi)毒素肽的研究大多處于實(shí)驗(yàn)階段，至今仍無(wú)有效低毒的藥物應(yīng)用于臨床，因此研制高親和力、能中和細(xì)菌LPS，同時(shí)兼有殺菌活性的藥物是當(dāng)今世界醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的重點(diǎn)。 如何能從源頭上封閉LPS的生物活性、阻止和切斷其所致一系列炎癥性“瀑布”反應(yīng)呢?據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，美洲鱟和東方鱟的鱟抗內(nèi)毒素因子(LALF及TALF)在體外和動(dòng)物體內(nèi)具有顯著的抗G-桿菌及中和LPS活性。LALF高親和性地以劑量依賴

4、方式結(jié)合LPS并封閉其生物學(xué)活性，對(duì)膿毒癥小鼠模型具有顯著保護(hù)作用，能有效延長(zhǎng)其生命，降低死亡率，抑制LPS誘導(dǎo)的TNFα分泌，避免臟器損傷。進(jìn)一步采用LALF的抗菌抗LPS活性功能區(qū)即第31-52氨基酸殘基序列的研究發(fā)現(xiàn)，不論是預(yù)防性或是治療性給予LALF31-52，均可顯著保護(hù)暴發(fā)性腹膜膿毒癥模型小鼠，改善全身性的TNFa反應(yīng)，減少器官損害，增加生存率。迄今的研究還證實(shí)，TALF41-53是結(jié)合LPS的最小序列，TALF29-59具

5、有與LPS結(jié)合最大潛能。 前人的研究成果為我們進(jìn)一步的研究奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)，為了能便捷獲得大量有效中和LPS的藥物前體，我們應(yīng)用生物信息學(xué)分析LALF、TALF及其功能區(qū)的結(jié)構(gòu)特性，應(yīng)用計(jì)算機(jī)分子模擬技術(shù)，設(shè)計(jì)并合成了一系列鱟抗內(nèi)毒素因子模擬肽，經(jīng)固相化學(xué)合成和一系列體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究，獲得了兩條具有較理想中和LPS及抗菌活性的鱟抗內(nèi)毒素因子模擬肽RREMP和TYS1。 研究主要結(jié)果和結(jié)論：1.通過在線使用PHD和GOR方法，

6、結(jié)合Antheprot5.0和APD對(duì)鱟抗內(nèi)毒素因子及其功能區(qū)位點(diǎn)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，準(zhǔn)確獲得了其分子結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)、分子動(dòng)力學(xué)的各項(xiàng)參數(shù)，如形成α螺旋、擴(kuò)展鏈、隨機(jī)卷曲的部位、構(gòu)成這些結(jié)構(gòu)的殘基數(shù)和比例，陽(yáng)性和陰性電荷的數(shù)目和空間分布狀況，分子的親疏水曲線、分子量、等電點(diǎn)、結(jié)合能等，為分子模擬設(shè)計(jì)提供豐富而準(zhǔn)確的信息。 2.通過計(jì)算機(jī)模擬設(shè)計(jì)，經(jīng)適當(dāng)變構(gòu)、修飾，成功獲得15條鱟抗內(nèi)毒素因子模擬肽序列。 3.通過固相多肽合成法

7、，采用多肽合成儀自動(dòng)合成和手工合成相結(jié)合，成功合成了16條/種鱟抗內(nèi)毒素因子模擬肽和對(duì)照肽。 4.通過鱟試驗(yàn)、生物傳感器親和力試驗(yàn)、細(xì)胞因子刺激試驗(yàn)、細(xì)胞毒性試驗(yàn)、體外抗菌試驗(yàn)及小鼠體內(nèi)LPS中和試驗(yàn)和保護(hù)試驗(yàn)等多種實(shí)驗(yàn)手段，在16條/種模擬肽中成功篩選出RREMP和TYS1兩條具有較好的體內(nèi)外LPS中和活性和抗菌活性的模擬肽RREMP和TYS1。 5.RREMP和TYS1在體內(nèi)外均能有效抑制由LPS介導(dǎo)的TNF-α的釋

8、放。對(duì)致死量LPS攻擊小鼠具有顯著保護(hù)作用，避免或減輕了小鼠器官組織結(jié)構(gòu)的損傷。5μM濃度保護(hù)下，小鼠7日生存率均為60％，生存時(shí)間明顯延長(zhǎng)。 6.RREMP和TYS1在體內(nèi)穩(wěn)定性好，LPS中和率高于同類文獻(xiàn)報(bào)道，極具希望成為理想的中和LPS藥物前體。 7.S4和S1兩條肽經(jīng)過轉(zhuǎn)鹽處理后活性發(fā)生了意想不到的根本改變，如醋酸鹽使原本具有良好體外中和LPS活性的S4喪失了活性，但卻使其拓寬了抗菌譜，增強(qiáng)了抗菌能力。相反，醋酸

9、鹽卻使原本不具LPS中和活性的S1呈現(xiàn)出了顯著的體內(nèi)外LPS中和活性及抗菌活性。說(shuō)明不同的鹽類對(duì)多肽的活性影響較大。 研究主要的創(chuàng)新點(diǎn)：1.研究在沒有大型計(jì)算機(jī)和昂貴的商用蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析軟件的情況下，應(yīng)用個(gè)人計(jì)算機(jī)利用免費(fèi)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析軟件和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器，成功設(shè)計(jì)并合成得到了全新的15條鱟抗內(nèi)毒素因子模擬肽序列，節(jié)省了大量實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi)。 2.通過對(duì)15條模擬肽的體內(nèi)外研究，得到了具有較強(qiáng)抗菌/抗內(nèi)毒素活性的S4、

10、RREMP和TYS1三條肽，其序列為自主設(shè)計(jì)，具有完全的知識(shí)產(chǎn)權(quán)。 3.RREMP和TYS1中和LPS活性穩(wěn)定，能有效抑制由LPS介導(dǎo)的TNF-α的釋放，對(duì)致死量LPS攻擊小鼠具有顯著保護(hù)作用，同時(shí)還具有抗G-菌和G+菌活性。作用與天然鱟抗內(nèi)毒素因子的功能區(qū)位點(diǎn)LALF31-52相當(dāng)或更強(qiáng)，具有潛在的藥用開發(fā)價(jià)值。 4.本研究對(duì)S4、S1轉(zhuǎn)鹽后的活性研究顯示，在合成肽的轉(zhuǎn)鹽過程中，不同的鹽類可使多肽活性產(chǎn)生根本性改變，是