HMGB1在電離輻射損傷中的作用與相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、目前，越來(lái)越多的基因被發(fā)現(xiàn)參與了電離輻射損傷，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)電離輻射損傷可以引起機(jī)體一些細(xì)胞因子、酶類和基因表達(dá)的改變，而一些分子的改變與機(jī)體的損傷程度和輻射劑量相關(guān)。研究基因在電離輻射損傷中的作用，針對(duì)這些基因的特性，運(yùn)用生物學(xué)手段改變機(jī)體對(duì)電離輻射的效應(yīng)成為放射醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一。HMGB1是一種存在于真核生物細(xì)胞內(nèi)的非組蛋白染色體結(jié)合蛋白，目前被認(rèn)為是一種危險(xiǎn)相關(guān)分子模式分子，在細(xì)胞的生存和死亡過(guò)程中發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)作用。本文研究

2、了細(xì)胞和機(jī)體接受電離輻射后HMGB1的變化，HMGB1在電離輻射損傷中的作用及其相關(guān)機(jī)制，以及通過(guò)RNAi抑制HMGB1的表達(dá)對(duì)細(xì)胞輻射敏感性的影響及機(jī)制。旨在尋找新的放射損傷生物標(biāo)志物和深入探討電離輻射損傷機(jī)理，為進(jìn)一步拓展電離輻射在醫(yī)學(xué)和生命科學(xué)中的應(yīng)用范圍和輻射防護(hù)損傷救治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本研究分為三個(gè)部分：
　　 第一部分：電離輻射誘導(dǎo)HMGB1的轉(zhuǎn)位和釋放。研究了電離輻射誘導(dǎo)細(xì)胞HMGB1的轉(zhuǎn)位和釋放，以及釋放的HMGB

3、1的劑量和時(shí)間效應(yīng)，為后續(xù)研究HMGB1在電離輻射損傷中的作用和機(jī)制奠定基礎(chǔ)。采用免疫熒光和Western blot觀察GM細(xì)胞和16HBE細(xì)胞受到8Gy6MV-X射線照射后24h細(xì)胞核和細(xì)胞漿中HMGB1的表達(dá)情況。用Western blot檢測(cè)12種細(xì)胞受到不同電離輻射后24h培養(yǎng)液中HMGB1的變化情況，以及細(xì)胞接受6Gy照射后不同時(shí)間HMGB1的變化情況。采用ELISA監(jiān)測(cè)在體動(dòng)物受到電離輻射后外周血HMGB1對(duì)照射劑量和照后時(shí)

4、間的變化情況，最后對(duì)正常人體和接受放療的腫瘤患者血清中HMGB1的含量進(jìn)行了初步分析。結(jié)果顯示：⑴當(dāng)接受8Gy6MV-X射線照射后24h，GM細(xì)胞和16HBE細(xì)胞核內(nèi)HMGB1向胞漿轉(zhuǎn)移。12種細(xì)胞在沒有電離輻射時(shí)細(xì)胞培養(yǎng)液中幾乎沒有或者有很少量的HMGB1蛋白，隨著劑量的增加，培養(yǎng)液中HMGB1含量也逐漸升高，呈劑量依賴性；細(xì)胞在接受6Gy6MV-X射線照射后細(xì)胞培養(yǎng)液中HMGB1含量隨觀察時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，具有時(shí)間累積效應(yīng)。⑵SD大

5、鼠在沒有接受電離輻射時(shí)外周血HMGB1的含量很低，約4.34μg/L，在接受不同劑量全身照射后24h，大鼠外周血HMGB1含量隨劑量的升高而增加。SD大鼠接受6Gy6MV-X射線全身照射后2h，外周血HMGB1含量開始升高，在24h左右達(dá)到高峰，約14.1μg/L，之后又有所下降，至照射后7d仍然高于照射前水平。⑶正常人外周血中HMGB1的含量為5.31±0.42μg/L，腫瘤患者放療前外周血HMGB1的含量平均為5.78±1.41μg

6、/L，照射30Gy時(shí)為5.76±1.38μg/L，照射50Cy時(shí)5.96±1.91μg/L，各組數(shù)值之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 第二部分：細(xì)胞外HMGB1在電離輻射損傷中的作用及其信號(hào)通路研究。研究了細(xì)胞外HMGB1是否參與了電離輻射損傷?并對(duì)相關(guān)機(jī)制進(jìn)行了初步探討。收集GM細(xì)胞和16HBE細(xì)胞接受8GyX射線照射24h后的培養(yǎng)基，即電離輻射條件培養(yǎng)基(ICM)，采用這種培養(yǎng)基分別培養(yǎng)未照射的GM細(xì)胞和16HBE細(xì)胞，以觀察細(xì)胞的

7、存活率和DNA雙鏈斷裂情況，了解照射導(dǎo)致釋放至細(xì)胞外的HMGB1對(duì)細(xì)胞的損傷情況。同時(shí)，加入抗HMGB1抗體中和條件培養(yǎng)基中的HMGB1進(jìn)行干預(yù)，觀察細(xì)胞的存活率和DNA雙鏈斷裂情況。用HMGB1的阻斷劑丙酮酸乙酯(EP)處理細(xì)胞和小鼠，觀察電離輻射對(duì)細(xì)胞和小鼠的損傷情況。采用免疫共沉淀技術(shù)研究HMGB1和受體蛋白R(shí)AGE的結(jié)合情況，Western blot檢測(cè)HMGB1發(fā)揮電離輻射損傷因子的細(xì)胞內(nèi)相關(guān)通路上磷酸化的ERK和JNK蛋白表

8、達(dá)情況。結(jié)果顯示：⑴MTT檢測(cè)細(xì)胞存活率表明：GM細(xì)胞和16HBE細(xì)胞接受4Gy照射后細(xì)胞存活率均下降，當(dāng)照射后即刻加入抗HMGB1抗體，其存活率回升，P<0.05。未照射的GM細(xì)胞和16HBE細(xì)胞在采用ICM培養(yǎng)后其細(xì)胞存活率亦出現(xiàn)下降，當(dāng)ICM中加入抗HMGB1抗體后，未照射的GM細(xì)胞和16HBE細(xì)胞的存活率提高，P<0.05。⑵免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)照射后即刻加入抗HMGB1抗體后，可以減少GM細(xì)胞和16HBE細(xì)胞在接受4Gy照

9、射后細(xì)胞核中γ-H2AX foci的數(shù)量。當(dāng)向細(xì)胞ICM中加入抗HMGB1抗體后可以減少GM細(xì)胞和16HBE細(xì)胞核中γ-H2AX foci的數(shù)量，P<0.05。⑶EP阻斷GM細(xì)胞和16HBE細(xì)胞接受4Gy照射后24h向細(xì)胞外釋放HMGB1，當(dāng)照射前24h加入EP(終濃度為10μm/L)后可以逆轉(zhuǎn)GM細(xì)胞和16HBE細(xì)胞在接受4Gy照射后的細(xì)胞存活率。當(dāng)照射前24h加入EP后可以減輕GM細(xì)胞和16HBE細(xì)胞在接受4Gy照射后細(xì)胞核中γ-H

10、2AX foci的數(shù)量，P<0.05。⑷EP延長(zhǎng)小鼠電離輻射后的生存時(shí)間結(jié)果表明，與12 Gy X-射線照射+生理鹽水組相比，照射前及照射后分別多次經(jīng)腹腔注射EP(總劑量為40mg/kg)的C57小鼠，其平均存活時(shí)間顯著增加(P<0.05)。⑸Westernblot分析電離輻射誘導(dǎo)RAGE的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，GM細(xì)胞和16HBE細(xì)胞在接受4Gy照射后24h細(xì)胞中RAGE的表達(dá)較對(duì)照組(0Gy)明顯升高，P<0.05。⑹IP結(jié)果顯示HMGB1存在

11、于RAGE的IP復(fù)合蛋白中，而RAGE蛋白也存在HMGB1的IP復(fù)合蛋白中。⑺Western blot分析細(xì)胞內(nèi)相關(guān)信號(hào)通路蛋白顯示：GM細(xì)胞和16HBE細(xì)胞在接受4Gy照射和條件培養(yǎng)基后24h，細(xì)胞中磷酸化的ERK和JNK蛋白呈高表達(dá)；在條件培養(yǎng)基中加入抗HMGB1抗體和抗RAGE抗體后24h，細(xì)胞中照射導(dǎo)致的磷酸化的ERK和JNK表達(dá)受到抑制。
　　 第三部分：RNAi降低HMGB1的表達(dá)對(duì)細(xì)胞輻射敏感性的影響及機(jī)制研究。通

12、過(guò)RNAi降低HMGB1的表達(dá)，研究HMGB1對(duì)細(xì)胞輻射敏感性的影響，并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行了初步探討，研究核內(nèi)HMGB1在電離輻射損傷中的作用和機(jī)制。采用HNGB1 siRNA降低GM細(xì)胞和16HBE細(xì)胞中HMGB1，并用RT-PCR和Western blot檢測(cè)細(xì)胞中HMGB1 mRNA和蛋白的抑制情況。MTT法測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期的改變，克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的細(xì)胞存活以及輻射敏感性，免疫熒光檢測(cè)γ-H2AX foci，We

13、stern blot分析細(xì)胞中與輻射損傷相關(guān)蛋白Ku-70、FEN-1和XRCC1蛋白的表達(dá)和信號(hào)通路相關(guān)蛋白NF-κB蛋白、DNA-PKC蛋白和磷酸化的AKT蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示：⑴采用HMGB1 siRNA和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法獲得成功降低HMGB1表達(dá)的GM細(xì)胞和16HBE細(xì)胞。⑵降低HMGB1后的GM細(xì)胞和16HBE細(xì)胞的形態(tài)并沒有發(fā)生明顯的變化，細(xì)胞周期以S細(xì)胞比例較多。⑶克隆形成實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，HMGB1 siRNA降低HMGB1的表達(dá)

14、可以提高GM細(xì)胞和16HBE細(xì)胞的輻射抗性，降低細(xì)胞核內(nèi)γ-H2AX foci的數(shù)量。⑷Western blot分析HMGB1 siRNA降低HMGB1的表達(dá)后，GM細(xì)胞和16HBE細(xì)胞中與輻射損傷相關(guān)蛋白Ku-70蛋白、FEN-1蛋白和XRCC1蛋白呈高表達(dá)，信號(hào)通路相關(guān)蛋白NF-κB蛋白、DNA-PKC蛋白和磷酸化的AKT蛋白的表達(dá)也表現(xiàn)為升高，在受到照射后升高更為明顯。結(jié)論：①電離輻射可以誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)HMGB1從核內(nèi)向胞漿中移位，并

15、導(dǎo)致HMGB1向細(xì)胞外釋放，而且釋放HMGB1的量具有時(shí)間和照射劑量依賴性。②SD大鼠接受全身照射后，外周血HMGB1含量升高，同樣具有劑量依賴性。大鼠在接受6Gy的6MV-X射線照射后2h，血清中的HMGB1蛋白水平即可見升高，并一直持續(xù)到照后7d，血清中仍然可以測(cè)定到較高的HMGB1水平。接受放療的腫瘤患者血清中HMGB1的變化則比較復(fù)雜，需擴(kuò)大樣本繼續(xù)研究。③細(xì)胞外HMGB1參與了細(xì)胞的電離輻射損傷，EP可以阻止細(xì)胞HMGB1的釋

16、放，減輕電離輻射對(duì)細(xì)胞的損傷。其具體機(jī)制可能是細(xì)胞外的HMGB1與細(xì)胞膜上的RAGE受體結(jié)合，激活了MAPK通路，進(jìn)而參與了細(xì)胞損傷。④HMGB1 siRNA可以降低GM細(xì)胞和16HBE細(xì)胞中HMGB1 mRNA和蛋白的表達(dá)。降低細(xì)胞內(nèi)HMGB1的表達(dá)可以抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，提高GM細(xì)胞和16HBE細(xì)胞的輻射抗性，并出現(xiàn)S期細(xì)胞周期阻滯，同時(shí)降低了DNA雙鏈斷裂程度。⑤下調(diào)HMGB1增加細(xì)胞輻射抗性的機(jī)制，可能與提高GM細(xì)胞和16HBE細(xì)胞中