TCTP在低劑量電離輻射適應(yīng)性反應(yīng)中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、電離輻射（Ionizingradiation,IR）作為重要的醫(yī)療、科研、能源等手段被人類廣泛利用，盡管高劑量IR的致癌致畸等損傷效應(yīng)已經(jīng)明確，低劑量IR的生物學(xué)效應(yīng)是否可由高劑量區(qū)簡(jiǎn)單外延卻始終是學(xué)術(shù)界爭(zhēng)論的焦點(diǎn)。隨著公眾暴露于低劑量IR的頻率迅速增加，建立合理有效的輻射風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)模型以及尋找可評(píng)估個(gè)體輻照敏感性的生物劑量計(jì)成為放射生物學(xué)界面臨的挑戰(zhàn)。
　　低劑量IR適應(yīng)性反應(yīng)（Adaptiveresponse,ARs）于1984

2、年在“Science”上首次被報(bào)道，是指機(jī)體/器官在受到低劑量輻照預(yù)刺激后，對(duì)繼發(fā)的內(nèi)源性損傷或高劑量IR損傷產(chǎn)生抗性。盡管大量研究認(rèn)為，ARs的產(chǎn)生與低劑量IR提高機(jī)體內(nèi)源的生理性DNA損傷修復(fù)能力密切相關(guān)，但其分子機(jī)制尚未闡明。尋找特異性的低劑量IR保護(hù)性反應(yīng)蛋白不僅對(duì)于建立可評(píng)估個(gè)體輻照敏感性的生物劑量計(jì)具有重要意義，也將為揭示生物體生理性的內(nèi)源DNA損傷修復(fù)體系，進(jìn)而闡明老化、退行性病變以及腫瘤發(fā)生等的原初機(jī)制提供新的思路和實(shí)驗(yàn)

3、依據(jù)。
　　本研究通過先進(jìn)的蛋白組學(xué)iTRAQ標(biāo)記串聯(lián)質(zhì)譜定量分析技術(shù)全面對(duì)比分析了正常人體皮膚細(xì)胞受到低劑量輻照后的蛋白差異表達(dá)譜，在此基礎(chǔ)上篩選出對(duì)低劑量輻照最為敏感的高表達(dá)蛋白TCTP。進(jìn)而，首次從量效反應(yīng)規(guī)律、蛋白功能、作用機(jī)制等方面全面探討了這一蛋白重要的放射生物學(xué)意義。研究結(jié)果不僅為尋找可用于評(píng)估放射敏感性的生物劑量計(jì)奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)，也為深入揭示細(xì)胞生理性的內(nèi)源DNA損傷修復(fù)體系開拓了新的思路和領(lǐng)域。
　　方法：

4、
　　1.利用iTRAQ標(biāo)記和串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)定量分析慢性低劑量（10cGy，0.2cGy/h）γ-射線輻照后，正常人體皮膚成纖維AG1522細(xì)胞的蛋白表達(dá)特征。
　　2.篩選出低劑量輻照后表達(dá)改變最為顯著的蛋白TCTP，觀察離體培養(yǎng)的正常人體皮膚成纖維細(xì)胞內(nèi)，TCTP對(duì)不同劑量、不同類型IR及多種過氧化環(huán)境損傷因素的反應(yīng)敏感性，初步探討其反應(yīng)規(guī)律。
　　3.通過建立三維立體皮膚模型及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證TCTP作為輻照敏感性指

5、示劑的可行性。
　　4.利用siRNA技術(shù)干擾AG1522細(xì)胞內(nèi)TCTP的表達(dá)后，通過微核形成（MicronucleusFormation,MN）評(píng)價(jià)輻照后DNA雙鏈斷裂（DNAdoublestrandbreaks,DSBs）及其修復(fù)情況、[3H]-thymidine標(biāo)定檢測(cè)G1/S阻滯間期，Western檢測(cè)DNA損傷修復(fù)相關(guān)蛋白p53、p21WAF1的調(diào)控。同時(shí)，觀察低劑量輻照后細(xì)胞核內(nèi)的TCTP定位表達(dá)改變，明確TCTP在I

6、R致DNA損傷修復(fù)中的作用。
　　5.通過封閉內(nèi)源性蛋白合成、抑制蛋白酶解途徑，觀察低/高劑量輻照后TCTP的翻譯后修飾改變；利用多種DNA損傷修復(fù)抑制劑，篩選低劑量γ-輻照后，TCTP參與DNA損傷修復(fù)的相關(guān)調(diào)控通路;以ATM基因突變(ATM+/-,ATM-/-)的皮膚成纖維細(xì)胞為平臺(tái)，探討TCTP的放射敏感性反應(yīng)與ATM相關(guān)性。
　　結(jié)果：
　　1.iTRAQ-MS共篩選出22種蛋白對(duì)低劑量輻照的反應(yīng)具有高敏感性，

7、其中，TCTP的表達(dá)改變最為顯著。
　　2.低劑量/低LET輻照特異性地引起TCTP表達(dá)上調(diào)屬于正常人體皮膚成纖維細(xì)胞內(nèi)的普遍性反應(yīng)。對(duì)比分析相同物理性質(zhì)的低LET射線（γ-或質(zhì)子）輻照后發(fā)現(xiàn)，10cGy均可引起TCTP蛋白表達(dá)顯著增加并可持續(xù)至照后24h，相反，4Gy高劑量輻照后，TCTP蛋白表達(dá)無(wú)變化甚至呈現(xiàn)降低趨勢(shì)；劑量-效應(yīng)關(guān)系分析表明，不同正常人體皮膚細(xì)胞（AG1522和GM5758）暴露于中低劑量γ-輻照（<50cGy

8、）后，TCTP均表達(dá)增加，暴露劑量>50cGy后，蛋白表達(dá)量逐漸降低。
　　3.三維皮膚成纖維細(xì)胞輻照模型及受照小鼠腦部、肺部均表現(xiàn)出TCTP對(duì)低劑量IR的高度反應(yīng)敏感性。利用細(xì)胞基質(zhì)生物碳支架（Cytomatrixcarbonscaffold，CCS）構(gòu)建三維皮膚成纖維細(xì)胞模型，經(jīng)過1-10cGyγ-輻照后發(fā)現(xiàn)，TCTP在低劑量輻照區(qū)具有高反應(yīng)敏感性。C3H/HeJ小鼠暴露于10cGyγ-輻照后，其腦部、肺部TCTP表達(dá)顯著增加

9、，4Gyγ-射線暴露未見類似反應(yīng)。
　　4.低劑量/低LET輻照導(dǎo)致的TCTP表達(dá)上調(diào)屬于氧化相關(guān)性調(diào)節(jié)。鑒于IR輻照屬于氧化相關(guān)性刺激因素之一，在對(duì)比分析其他氧化損傷（過熱、過氧化）因素后發(fā)現(xiàn)，低劑量刺激時(shí)，TCTP表達(dá)顯著上調(diào)；而高劑量損傷性刺激未見TCTP表達(dá)改變甚至出現(xiàn)下降，其變化趨勢(shì)類似于低LET的γ-或質(zhì)子輻照效應(yīng)。相反，非氧化相關(guān)因素UVC輻照后TCTP的表達(dá)未見改變。
　　5.低劑量γ-輻照引起AG1522細(xì)

10、胞內(nèi)TCTP蛋白的穩(wěn)定性增加；相反，高劑量輻照時(shí)TCTP發(fā)生降解。10cGyγ-輻照后，AG1522細(xì)胞內(nèi)的TCTP蛋白穩(wěn)定性增加；同時(shí)，4Gy輻照后，TCTP通過蛋白酶體途徑發(fā)生降解。
　　6.低劑量γ-輻照后，TCTP通過細(xì)胞核內(nèi)高表達(dá)直接參與DNA雙鏈斷裂修復(fù)和輻照后p53的穩(wěn)定性調(diào)控，該反應(yīng)為ATM和其它PI3K家族成員依賴性，而p53、HDM2非依賴性。利用siRNA技術(shù)抑制AG1522細(xì)胞內(nèi)TCTP的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞暴露

11、于10cGyγ-輻照后p53蛋白的穩(wěn)定性受到嚴(yán)重影響，DNA雙鏈斷裂修復(fù)幾乎完全受阻；極低劑量1cGyγ-急性輻照，細(xì)胞核內(nèi)便可出現(xiàn)TCTP顯著高表達(dá)，證實(shí)TCTP直接參與了低劑量γ-輻照后的DNA損傷修復(fù)過程。利用多種特異的DNA損傷修復(fù)抑制劑復(fù)合10cGy輻照后發(fā)現(xiàn)，低劑量輻照時(shí)TCTP的核內(nèi)高表達(dá)屬于ATM和PI3K家族成員依賴性，而p53、HDM2非依賴性途徑調(diào)控；ATM-/-皮膚成纖維細(xì)胞中，TCTP對(duì)低劑量IR的反應(yīng)敏感性缺

12、失，進(jìn)一步證實(shí)低劑量輻照后TCTP調(diào)控的ATM依賴性。
　　7.高劑量輻照所致的DNA損傷修復(fù)中，TCTP主要參與了p53下游的G1/S細(xì)胞檢測(cè)點(diǎn)調(diào)控。轉(zhuǎn)染TCTPsiRNA的細(xì)胞受到4Gy高劑量γ-輻照后，其p53表達(dá)以及DNA損傷修復(fù)趨勢(shì)同對(duì)照組無(wú)顯著差異；但是，其G1期阻滯時(shí)間較陽(yáng)性對(duì)照組明顯縮短～5.5h，p21WAF1活化受阻。
　　結(jié)論：
　　1.人體細(xì)胞內(nèi)存在內(nèi)源性、生理性的DNA損傷修復(fù)體系，該體系也許

13、交叉但不能完全等同于強(qiáng)應(yīng)激病理狀態(tài)下的損傷修復(fù)體系，因此低劑量IR劑量-效應(yīng)關(guān)系不應(yīng)從高劑量反應(yīng)曲線任意外延；
　　2.正常人體皮膚細(xì)胞暴露于低劑量/高劑量IR后，TCTP的反應(yīng)敏感性及功能不同；
　　3.首次證實(shí)TCTP參與低劑量IR引起的DNA雙鏈斷裂損傷修復(fù)及p53調(diào)控；
　　4.首次證實(shí)正常人體皮膚細(xì)胞受到高劑量IR輻照后，TCTP在G1/S細(xì)胞檢測(cè)點(diǎn)調(diào)控中發(fā)揮了重要作用；
　　5.TCTP可能成為理想的