丹參素對(duì)電離輻射損傷的防護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：
　　近年來(lái)，核能和核技術(shù)廣泛應(yīng)用于能源、醫(yī)療、軍事、食品加工、育種等國(guó)防和國(guó)民生活的方方面面，與人們?nèi)粘Ｉ钕⑾⑾嚓P(guān)。目前，可能受到放射線損傷的人群主要有接受放療的癌癥病人；從事與放射相關(guān)的工作人員，如放射科室的醫(yī)務(wù)人員、核電站與輻射加工企業(yè)的工作人員、從事與核科學(xué)有關(guān)研究的科研工作者、各種核事故的波及人員以及宇航人員等，輻射在給人類造福的同時(shí)，對(duì)人們的健康也帶來(lái)不同程度的威脅。
　　電離輻射對(duì)生物體造成損傷主要

2、通過(guò)兩種方式，一是直接作用，指由射線造成生物大分子的損傷，電離輻射的能量直接沉積于生物大分子，造成DNA鏈的斷裂、蛋白酶失活或者破壞細(xì)胞內(nèi)的膜的結(jié)構(gòu)或通透性，從而影響細(xì)胞的正常功能。二是間接作用，指生物大分子的破壞和失活是由于電離輻射作用于水分子，繼而水的輻射分解產(chǎn)物再作用于生物大分子，引起后者的物理和化學(xué)變化，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。細(xì)胞經(jīng)受輻射的直接作用和間接作用后，細(xì)胞膜和細(xì)胞內(nèi)DNA發(fā)生改變以及大量ROS的產(chǎn)生，誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)分子

3、的活化，或信號(hào)通路的激活，最終導(dǎo)致輻射后細(xì)胞凋亡、癌變，甚至機(jī)體死亡。
　　電離輻射對(duì)機(jī)體的損傷極大。迄今為止，雖然發(fā)現(xiàn)了一些有效預(yù)防損傷的化合物，如五十年前就已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了氨巰基化合物，三十年前合成的WR系列化合物等，這些已開發(fā)的抗輻射藥物盡管擁有很好的抗輻射作用，但尚存在毒性大、不良反應(yīng)多等多方面的不足，人們迫切希望能開發(fā)出毒性小，可用于臨床防治電離輻射損傷的藥物。
　　丹參素(SalvianicacidA)是從唇形科植物丹

4、參水溶性成分中提取的多酚類物質(zhì)，大量實(shí)驗(yàn)報(bào)道，丹參素具有抗炎、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抗腫瘤、保護(hù)肝臟、抑制肝纖維化、保護(hù)心肌細(xì)胞及中樞神經(jīng)系統(tǒng)、防治心腦血管疾病的作用。我們前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，丹參素能廣泛地清除各種自由基，降低小鼠經(jīng)電離輻照后的死亡率，并明顯減輕在體和離體實(shí)驗(yàn)中輻射引起的各種損傷。本實(shí)驗(yàn)擬進(jìn)一步觀察丹參素的輻射防護(hù)作用，并研究丹參素的輻射防護(hù)作用是否與其保護(hù)細(xì)胞DNA不受損傷、抑制細(xì)胞凋亡有關(guān)，進(jìn)一步在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中探索丹參素發(fā)揮輻射防

5、護(hù)作用時(shí)參與的信號(hào)通路及其可能的作用機(jī)制。
　　實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?br>　　1.觀察丹參素對(duì)輻射損傷小鼠的保護(hù)作用。
　　2.觀察丹參素對(duì)輻射引起人正常細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的作用；并進(jìn)一步研究丹參素對(duì)輻射損傷細(xì)胞形態(tài)、DNA、線粒體等的保護(hù)作用；
　　3.探索丹參素輻射防護(hù)作用的可能機(jī)制以及信號(hào)通路；
　　實(shí)驗(yàn)方法：
　　動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
　　雄性BALB/c小鼠(22±2g)適應(yīng)環(huán)境后，隨機(jī)分為五組:1)生理鹽水對(duì)照組，

6、2)單獨(dú)照射組，3)丹參素10mg/Kg組，4)丹參素20mg/Kg組，5)陽(yáng)性對(duì)照雌三醇（E3，2mg/Kg）組。不同濃度丹參素灌胃7天，陽(yáng)性對(duì)照E3組在輻照前48h,24h,0h分別腹腔給藥3次，然后給予不同劑量的γ射線照射。并于輻照后不同時(shí)間取材，觀察丹參素對(duì)輻射損傷小鼠的生存率的影響，外周血中白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血紅蛋白和血小板含量的變化，脾臟的病理學(xué)以及脾臟造血干細(xì)胞克隆形成率的改變，骨髓有核細(xì)胞數(shù)以及小鼠肝臟抗氧化能力的變化。<

7、br>　　細(xì)胞實(shí)驗(yàn)
　　借助MTT法檢測(cè)丹參素對(duì)四種人正常細(xì)胞的毒性和輻射防護(hù)作用，進(jìn)一步采用克隆形成法觀察丹參素對(duì)輻射損傷的L-02和HIEC細(xì)胞增殖能力的影響，然后用微核法，彗星尾實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞免疫熒光觀察丹參素對(duì)輻照細(xì)胞DNA的保護(hù)作用，最后分別使用熒光探針和生化方法檢測(cè)丹參素對(duì)輻照損傷細(xì)胞的線粒體和氧化還原系統(tǒng)的保護(hù)作用。
　　為了研究丹參素對(duì)輻照損傷細(xì)胞中凋亡相關(guān)的信號(hào)通路的影響，取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的L-02細(xì)胞與丹參素共孵

8、育1h后給予γ射線照射，繼續(xù)分別培養(yǎng)不同時(shí)間，用WesternBlot方法檢測(cè)細(xì)胞中凋亡通路、DNA修復(fù)、JNK通路和Ca2+通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，用比色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡通路中蛋白激酶的變化。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　(1)丹參素對(duì)輻射損傷小鼠的保護(hù)作用
　　丹參素可以提高8Gy照射后30天小鼠的存活率，可以明顯抑制4Gyγ射線照射后28天內(nèi)外周血紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血紅蛋白和血小板減少。
　　丹參素可減輕由輻照所致的小鼠脾

9、臟重量的過(guò)度減輕，而且經(jīng)丹參素預(yù)處理后，受照小鼠內(nèi)源性脾結(jié)節(jié)較照射組均明顯增多。形態(tài)學(xué)觀察表明，4Gyγ射線照射后即可見脾臟體積明顯縮小，脾切面上脾小體縮小或完全消失，大量淋巴細(xì)胞凋亡，而照前給予丹參素則能有效的抑制輻射引起的生發(fā)中心的萎縮，減少淋巴細(xì)胞凋亡。同時(shí)經(jīng)丹參素處理過(guò)的小鼠骨髓細(xì)胞中的有核細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯多于照射組，表明丹參素能增強(qiáng)骨髓細(xì)胞對(duì)輻射的耐受性。丹參素預(yù)處理能增強(qiáng)小鼠肝臟抗氧化酶類的活性，減少肝臟蛋白的氧化水平并抑制肝臟

10、的脂質(zhì)過(guò)氧化水平。
　　(2)丹參素預(yù)處理對(duì)四種人正常細(xì)胞的毒性和輻射防護(hù)作用
　　MTT法實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同濃度的丹參素對(duì)L-02、HIEC、GES、HaCaT四種人正常細(xì)胞都沒有產(chǎn)生明顯毒性，而且在孵育1h時(shí)，丹參素對(duì)四種細(xì)胞均表現(xiàn)出促進(jìn)增殖的作用，因此我們選擇丹參素提前孵育1h做后續(xù)的輻射防護(hù)實(shí)驗(yàn)。在之后的輻射防護(hù)實(shí)驗(yàn)中，四種細(xì)胞的活力在經(jīng)過(guò)γ射線的照射后都有不同程度的下降，而丹參素1h的預(yù)處理則能明顯提高四種細(xì)胞的生

11、存數(shù)量，其中10μg/ml丹參素的作用效果最明顯。根據(jù)細(xì)胞對(duì)γ射線和丹參素的敏感性，我們選用了L-02和HIEC兩種細(xì)胞做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　(3)丹參素對(duì)L-02和HIEC細(xì)胞輻射損傷的防護(hù)作用
　　首先細(xì)胞克隆形成和凋亡實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明細(xì)胞輻照前1h給予丹參素孵育能顯著提高細(xì)胞的增殖能力，增加細(xì)胞的克隆形成數(shù)(P<0.01)，并能顯著減少細(xì)胞凋亡(P<0.01)。而且丹參素預(yù)處理也能明顯減少輻射損傷細(xì)胞形態(tài)的改變和細(xì)胞核的損傷

12、。ER
　　與單純照射組相比，丹參素預(yù)處理組γ-H2AX活化的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)以及活化強(qiáng)度有明顯減輕，說(shuō)明丹參素降低了γ射線輻照后細(xì)胞DNA受損程度。另外微核實(shí)驗(yàn)中丹參素的預(yù)處理能夠明顯減少微核的形成率，減輕輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞核的損傷。彗星尾實(shí)驗(yàn)中，丹參素預(yù)處理組較單純照射組中細(xì)胞的尾長(zhǎng)縮短、尾部DNA的百分比下降、尾矩減小，顯示丹參素對(duì)輻射損傷的DNA有保護(hù)作用。
　　對(duì)細(xì)胞線粒體膜電位的測(cè)定結(jié)果顯示丹參素預(yù)處理過(guò)的細(xì)胞表現(xiàn)出膜電位

13、恢復(fù)的現(xiàn)象(P<0.01)。另外，我們的研究發(fā)現(xiàn)丹參素預(yù)處理能明顯減少輻射在L-02和HIEC細(xì)胞內(nèi)的ROS(P<0.05)，還能在一定程度上恢復(fù)細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶的活性，增加抗氧化物質(zhì)的含量，減輕細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化的程度，維持細(xì)胞氧化還原系統(tǒng)的正常功能。
　　(4)丹參素對(duì)輻射誘導(dǎo)細(xì)胞中凋亡相關(guān)通路活化的抑制作用
　　凋亡相關(guān)蛋白的檢測(cè)結(jié)果顯示照射后48h細(xì)胞內(nèi)，與單純照射組相比，Bax/Bcl-2的比值隨著丹參素濃度的升高而有顯

14、著降低，而p53的表達(dá)隨著預(yù)處理丹參素濃度的升高也是有顯著降低，。這些說(shuō)明丹參素能夠促進(jìn)抗凋亡蛋白的表達(dá)，抑制促凋亡蛋白的表達(dá)。細(xì)胞經(jīng)過(guò)4Gyγ射線照射后，從線粒體釋放到胞漿中的Cyt-C和AIF的蛋白含量顯著上升，而經(jīng)丹參素預(yù)處理之后再給予4Gyγ射線照射能夠降低Cyt-C和AIF的釋放，從而抑制由線粒體損傷引起的細(xì)胞凋亡。另外，細(xì)胞內(nèi)由輻射引起的Caspase3/8/9蛋白激酶的活化在丹參素的干預(yù)下都有所減少，上述結(jié)果表明，丹參素能

15、夠通過(guò)抑制蛋白激酶的活化從而降低輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。
　　(5)丹參素對(duì)輻射損傷細(xì)胞DNA的保護(hù)作用
　　細(xì)胞內(nèi)γ-H2AX在4Gy射線照射后，即刻開始出現(xiàn)，3h達(dá)到最高峰；而經(jīng)過(guò)丹參素干預(yù)的實(shí)驗(yàn)組γ-H2AX在照后1h就達(dá)到最高峰；說(shuō)明丹參素預(yù)處理能夠加快H2AX的磷酸化，促進(jìn)損傷DNA的修復(fù)。
　　輻照組γ-H2AX的上游分子ATM的表達(dá)水平從照后即刻開始到輻照后3h，逐漸增加，之后反而下降。而丹參素處理組中ATM

16、從照后即刻開始直至照后3h一直處于活化狀態(tài)。RT-PCR的結(jié)果顯示經(jīng)丹參素預(yù)處理的輻射損傷細(xì)胞中的ATM上調(diào)最多，但是4Gy單純照射組和丹參素+輻照組與對(duì)照相比均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。這說(shuō)明丹參素對(duì)輻射損傷的細(xì)胞中ATM表達(dá)的影響主要集中在蛋白的合成和降解上。
　　(6)丹參素對(duì)輻射誘導(dǎo)細(xì)胞中JNK信號(hào)通路活化的抑制作用
　　丹參素預(yù)處理L-02細(xì)胞1h后經(jīng)4Gyγ射線照射，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后，p38和JNK的表達(dá)均無(wú)明顯變化，磷酸

17、化的p38蛋白也沒有明顯變化，而磷酸化的JNK蛋白，p-JNK在受照后顯著增加，而丹參素的預(yù)處理則能抑制輻射誘導(dǎo)的JNK蛋白的磷酸化，說(shuō)明丹參素抑制輻射誘導(dǎo)的JNK激酶的磷酸化。經(jīng)過(guò)丹參素預(yù)處理4Gyγ射線照射，繼續(xù)培養(yǎng)12小時(shí)后，JNK激酶的上游分子p-MKK4的表達(dá)水平在輻照后顯著升高，而丹參素預(yù)處理能降低p-MKK4的表達(dá)水平，MKK4的表達(dá)沒有變化，NFκB的表達(dá)水平在細(xì)胞輻照后有所上升，但是丹參素對(duì)于輻照后NFκB的表達(dá)沒有影

18、響。
　　使用JNK的特異性抑制劑SP600125，輻照后36hJNK通路下游分子c-Jun和ATF-2的表達(dá)在丹參素作用下被抑制，而在正常情況下對(duì)它們的表達(dá)沒有影響。此結(jié)果表明，丹參素能夠抑制MKK4/JNK通路的活化，從而減少輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。
　　(7)丹參素對(duì)輻射誘導(dǎo)細(xì)胞中Ca2+介導(dǎo)的凋亡通路活化的抑制
　　丹參素預(yù)處理L-02細(xì)胞1h后經(jīng)4Gyγ射線照射，照后3h細(xì)胞內(nèi)Ca2+由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放，與對(duì)照組相比，

19、丹參素預(yù)處理組的Ca2+釋放強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)則都有所減弱。Ca2+通路的鈣調(diào)蛋白calpain-2在4Gyγ射線照后表達(dá)量顯著升高，而在丹參素預(yù)處理組中鈣調(diào)蛋白calpain-2的表達(dá)量升高幅度明顯降低。
　　結(jié)論：
　　1.在體實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明丹參素能明顯延長(zhǎng)和提高輻照小鼠的生存時(shí)間和存活率，丹參素能明顯降低受照小鼠外周血、脾臟、骨髓細(xì)胞的損傷程度，并能增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力。
　　2.丹參素對(duì)L-02、HIEC、GES、