丹參素對電離輻射損傷的防護作用及機制研究.pdf

1、研究背景：
　　近年來，核能和核技術(shù)廣泛應(yīng)用于能源、醫(yī)療、軍事、食品加工、育種等國防和國民生活的方方面面，與人們?nèi)粘Ｉ钕⑾⑾嚓P(guān)。目前，可能受到放射線損傷的人群主要有接受放療的癌癥病人；從事與放射相關(guān)的工作人員，如放射科室的醫(yī)務(wù)人員、核電站與輻射加工企業(yè)的工作人員、從事與核科學(xué)有關(guān)研究的科研工作者、各種核事故的波及人員以及宇航人員等，輻射在給人類造福的同時，對人們的健康也帶來不同程度的威脅。
　　電離輻射對生物體造成損傷主要

2、通過兩種方式，一是直接作用，指由射線造成生物大分子的損傷，電離輻射的能量直接沉積于生物大分子，造成DNA鏈的斷裂、蛋白酶失活或者破壞細胞內(nèi)的膜的結(jié)構(gòu)或通透性，從而影響細胞的正常功能。二是間接作用，指生物大分子的破壞和失活是由于電離輻射作用于水分子，繼而水的輻射分解產(chǎn)物再作用于生物大分子，引起后者的物理和化學(xué)變化，從而誘導(dǎo)細胞凋亡。細胞經(jīng)受輻射的直接作用和間接作用后，細胞膜和細胞內(nèi)DNA發(fā)生改變以及大量ROS的產(chǎn)生，誘導(dǎo)細胞內(nèi)多種信號分子

3、的活化，或信號通路的激活，最終導(dǎo)致輻射后細胞凋亡、癌變，甚至機體死亡。
　　電離輻射對機體的損傷極大。迄今為止，雖然發(fā)現(xiàn)了一些有效預(yù)防損傷的化合物，如五十年前就已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了氨巰基化合物，三十年前合成的WR系列化合物等，這些已開發(fā)的抗輻射藥物盡管擁有很好的抗輻射作用，但尚存在毒性大、不良反應(yīng)多等多方面的不足，人們迫切希望能開發(fā)出毒性小，可用于臨床防治電離輻射損傷的藥物。
　　丹參素(SalvianicacidA)是從唇形科植物丹

4、參水溶性成分中提取的多酚類物質(zhì)，大量實驗報道，丹參素具有抗炎、增強機體免疫力、抗腫瘤、保護肝臟、抑制肝纖維化、保護心肌細胞及中樞神經(jīng)系統(tǒng)、防治心腦血管疾病的作用。我們前期實驗發(fā)現(xiàn)，丹參素能廣泛地清除各種自由基，降低小鼠經(jīng)電離輻照后的死亡率，并明顯減輕在體和離體實驗中輻射引起的各種損傷。本實驗擬進一步觀察丹參素的輻射防護作用，并研究丹參素的輻射防護作用是否與其保護細胞DNA不受損傷、抑制細胞凋亡有關(guān)，進一步在細胞實驗中探索丹參素發(fā)揮輻射防

5、護作用時參與的信號通路及其可能的作用機制。
　　實驗?zāi)康模?br>　　1.觀察丹參素對輻射損傷小鼠的保護作用。
　　2.觀察丹參素對輻射引起人正常細胞生長抑制的作用；并進一步研究丹參素對輻射損傷細胞形態(tài)、DNA、線粒體等的保護作用；
　　3.探索丹參素輻射防護作用的可能機制以及信號通路；
　　實驗方法：
　　動物實驗
　　雄性BALB/c小鼠(22±2g)適應(yīng)環(huán)境后，隨機分為五組:1)生理鹽水對照組，

6、2)單獨照射組，3)丹參素10mg/Kg組，4)丹參素20mg/Kg組，5)陽性對照雌三醇（E3，2mg/Kg）組。不同濃度丹參素灌胃7天，陽性對照E3組在輻照前48h,24h,0h分別腹腔給藥3次，然后給予不同劑量的γ射線照射。并于輻照后不同時間取材，觀察丹參素對輻射損傷小鼠的生存率的影響，外周血中白細胞、紅細胞、血紅蛋白和血小板含量的變化，脾臟的病理學(xué)以及脾臟造血干細胞克隆形成率的改變，骨髓有核細胞數(shù)以及小鼠肝臟抗氧化能力的變化。<

7、br>　　細胞實驗
　　借助MTT法檢測丹參素對四種人正常細胞的毒性和輻射防護作用，進一步采用克隆形成法觀察丹參素對輻射損傷的L-02和HIEC細胞增殖能力的影響，然后用微核法，彗星尾實驗，細胞免疫熒光觀察丹參素對輻照細胞DNA的保護作用，最后分別使用熒光探針和生化方法檢測丹參素對輻照損傷細胞的線粒體和氧化還原系統(tǒng)的保護作用。
　　為了研究丹參素對輻照損傷細胞中凋亡相關(guān)的信號通路的影響，取對數(shù)期生長的L-02細胞與丹參素共孵

8、育1h后給予γ射線照射，繼續(xù)分別培養(yǎng)不同時間，用WesternBlot方法檢測細胞中凋亡通路、DNA修復(fù)、JNK通路和Ca2+通路相關(guān)蛋白的表達，用比色法檢測細胞凋亡通路中蛋白激酶的變化。
　　實驗結(jié)果：
　　(1)丹參素對輻射損傷小鼠的保護作用
　　丹參素可以提高8Gy照射后30天小鼠的存活率，可以明顯抑制4Gyγ射線照射后28天內(nèi)外周血紅細胞、白細胞、血紅蛋白和血小板減少。
　　丹參素可減輕由輻照所致的小鼠脾

9、臟重量的過度減輕，而且經(jīng)丹參素預(yù)處理后，受照小鼠內(nèi)源性脾結(jié)節(jié)較照射組均明顯增多。形態(tài)學(xué)觀察表明，4Gyγ射線照射后即可見脾臟體積明顯縮小，脾切面上脾小體縮小或完全消失，大量淋巴細胞凋亡，而照前給予丹參素則能有效的抑制輻射引起的生發(fā)中心的萎縮，減少淋巴細胞凋亡。同時經(jīng)丹參素處理過的小鼠骨髓細胞中的有核細胞計數(shù)明顯多于照射組，表明丹參素能增強骨髓細胞對輻射的耐受性。丹參素預(yù)處理能增強小鼠肝臟抗氧化酶類的活性，減少肝臟蛋白的氧化水平并抑制肝臟

10、的脂質(zhì)過氧化水平。
　　(2)丹參素預(yù)處理對四種人正常細胞的毒性和輻射防護作用
　　MTT法實驗結(jié)果顯示，不同濃度的丹參素對L-02、HIEC、GES、HaCaT四種人正常細胞都沒有產(chǎn)生明顯毒性，而且在孵育1h時，丹參素對四種細胞均表現(xiàn)出促進增殖的作用，因此我們選擇丹參素提前孵育1h做后續(xù)的輻射防護實驗。在之后的輻射防護實驗中，四種細胞的活力在經(jīng)過γ射線的照射后都有不同程度的下降，而丹參素1h的預(yù)處理則能明顯提高四種細胞的生

11、存數(shù)量，其中10μg/ml丹參素的作用效果最明顯。根據(jù)細胞對γ射線和丹參素的敏感性，我們選用了L-02和HIEC兩種細胞做后續(xù)實驗。
　　(3)丹參素對L-02和HIEC細胞輻射損傷的防護作用
　　首先細胞克隆形成和凋亡實驗的結(jié)果表明細胞輻照前1h給予丹參素孵育能顯著提高細胞的增殖能力，增加細胞的克隆形成數(shù)(P<0.01)，并能顯著減少細胞凋亡(P<0.01)。而且丹參素預(yù)處理也能明顯減少輻射損傷細胞形態(tài)的改變和細胞核的損傷

12、。ER
　　與單純照射組相比，丹參素預(yù)處理組γ-H2AX活化的陽性細胞數(shù)以及活化強度有明顯減輕，說明丹參素降低了γ射線輻照后細胞DNA受損程度。另外微核實驗中丹參素的預(yù)處理能夠明顯減少微核的形成率，減輕輻射誘導(dǎo)的細胞核的損傷。彗星尾實驗中，丹參素預(yù)處理組較單純照射組中細胞的尾長縮短、尾部DNA的百分比下降、尾矩減小，顯示丹參素對輻射損傷的DNA有保護作用。
　　對細胞線粒體膜電位的測定結(jié)果顯示丹參素預(yù)處理過的細胞表現(xiàn)出膜電位

13、恢復(fù)的現(xiàn)象(P<0.01)。另外，我們的研究發(fā)現(xiàn)丹參素預(yù)處理能明顯減少輻射在L-02和HIEC細胞內(nèi)的ROS(P<0.05)，還能在一定程度上恢復(fù)細胞內(nèi)抗氧化酶的活性，增加抗氧化物質(zhì)的含量，減輕細胞脂質(zhì)過氧化的程度，維持細胞氧化還原系統(tǒng)的正常功能。
　　(4)丹參素對輻射誘導(dǎo)細胞中凋亡相關(guān)通路活化的抑制作用
　　凋亡相關(guān)蛋白的檢測結(jié)果顯示照射后48h細胞內(nèi)，與單純照射組相比，Bax/Bcl-2的比值隨著丹參素濃度的升高而有顯

14、著降低，而p53的表達隨著預(yù)處理丹參素濃度的升高也是有顯著降低，。這些說明丹參素能夠促進抗凋亡蛋白的表達，抑制促凋亡蛋白的表達。細胞經(jīng)過4Gyγ射線照射后，從線粒體釋放到胞漿中的Cyt-C和AIF的蛋白含量顯著上升，而經(jīng)丹參素預(yù)處理之后再給予4Gyγ射線照射能夠降低Cyt-C和AIF的釋放，從而抑制由線粒體損傷引起的細胞凋亡。另外，細胞內(nèi)由輻射引起的Caspase3/8/9蛋白激酶的活化在丹參素的干預(yù)下都有所減少，上述結(jié)果表明，丹參素能

15、夠通過抑制蛋白激酶的活化從而降低輻射誘導(dǎo)的細胞凋亡。
　　(5)丹參素對輻射損傷細胞DNA的保護作用
　　細胞內(nèi)γ-H2AX在4Gy射線照射后，即刻開始出現(xiàn)，3h達到最高峰；而經(jīng)過丹參素干預(yù)的實驗組γ-H2AX在照后1h就達到最高峰；說明丹參素預(yù)處理能夠加快H2AX的磷酸化，促進損傷DNA的修復(fù)。
　　輻照組γ-H2AX的上游分子ATM的表達水平從照后即刻開始到輻照后3h，逐漸增加，之后反而下降。而丹參素處理組中ATM

16、從照后即刻開始直至照后3h一直處于活化狀態(tài)。RT-PCR的結(jié)果顯示經(jīng)丹參素預(yù)處理的輻射損傷細胞中的ATM上調(diào)最多，但是4Gy單純照射組和丹參素+輻照組與對照相比均無統(tǒng)計學(xué)差異。這說明丹參素對輻射損傷的細胞中ATM表達的影響主要集中在蛋白的合成和降解上。
　　(6)丹參素對輻射誘導(dǎo)細胞中JNK信號通路活化的抑制作用
　　丹參素預(yù)處理L-02細胞1h后經(jīng)4Gyγ射線照射，繼續(xù)培養(yǎng)24小時后，p38和JNK的表達均無明顯變化，磷酸

17、化的p38蛋白也沒有明顯變化，而磷酸化的JNK蛋白，p-JNK在受照后顯著增加，而丹參素的預(yù)處理則能抑制輻射誘導(dǎo)的JNK蛋白的磷酸化，說明丹參素抑制輻射誘導(dǎo)的JNK激酶的磷酸化。經(jīng)過丹參素預(yù)處理4Gyγ射線照射，繼續(xù)培養(yǎng)12小時后，JNK激酶的上游分子p-MKK4的表達水平在輻照后顯著升高，而丹參素預(yù)處理能降低p-MKK4的表達水平，MKK4的表達沒有變化，NFκB的表達水平在細胞輻照后有所上升，但是丹參素對于輻照后NFκB的表達沒有影

18、響。
　　使用JNK的特異性抑制劑SP600125，輻照后36hJNK通路下游分子c-Jun和ATF-2的表達在丹參素作用下被抑制，而在正常情況下對它們的表達沒有影響。此結(jié)果表明，丹參素能夠抑制MKK4/JNK通路的活化，從而減少輻射誘導(dǎo)的細胞凋亡。
　　(7)丹參素對輻射誘導(dǎo)細胞中Ca2+介導(dǎo)的凋亡通路活化的抑制
　　丹參素預(yù)處理L-02細胞1h后經(jīng)4Gyγ射線照射，照后3h細胞內(nèi)Ca2+由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放，與對照組相比，

19、丹參素預(yù)處理組的Ca2+釋放強度和陽性細胞數(shù)則都有所減弱。Ca2+通路的鈣調(diào)蛋白calpain-2在4Gyγ射線照后表達量顯著升高，而在丹參素預(yù)處理組中鈣調(diào)蛋白calpain-2的表達量升高幅度明顯降低。
　　結(jié)論：
　　1.在體實驗結(jié)果說明丹參素能明顯延長和提高輻照小鼠的生存時間和存活率，丹參素能明顯降低受照小鼠外周血、脾臟、骨髓細胞的損傷程度，并能增強機體的抗氧化能力。
　　2.丹參素對L-02、HIEC、GES、