HMGB1在非小細(xì)胞肺癌及急性肺損傷中的作用機制研究.pdf

1、第一部分HMGB1在非小細(xì)胞肺癌中的發(fā)病作用及機制
　　 肺癌的發(fā)病率和死亡率都持續(xù)增高，探討肺癌的相關(guān)細(xì)胞因子及發(fā)病機制，對減少肺癌發(fā)病率有非常重要的作用。研究表明，HMGB1與非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移有非常密切的關(guān)系。
　　 高遷移率族蛋白B1(high-mobilitygroupbox-B1，HMGB1)廣泛存在于真核生物細(xì)胞內(nèi)，在許多生物學(xué)過程中，HMGB1都有非常重要的作用。HMGB1的表達(dá)水平增高可以導(dǎo)

2、致細(xì)胞分化、細(xì)胞遷移并促進細(xì)胞增殖。HMGB1可以促進細(xì)胞生長和基因轉(zhuǎn)錄，高遷移率族蛋白與腫瘤的許多生物學(xué)特性也有非常密切的關(guān)系，如腫瘤的發(fā)生、浸潤、轉(zhuǎn)移等。
　　 高遷移率族蛋白的各種生物學(xué)活性都是與其相應(yīng)受體的結(jié)合而實現(xiàn)的，晚期糖基化終末產(chǎn)物(RAGE)受體是HMGB1的最主要受體。當(dāng)HMGB1與RAGE結(jié)合時，有兩條主要的下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被激活:第一條通路是鳥苷三磷酸酶(Rac)和CDC42途徑被激活，產(chǎn)生相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)

3、，包括細(xì)胞骨架的重塑、細(xì)胞運動、細(xì)胞遷移和腫瘤的生長、遷移及增殖;第二條通路是絲裂原活化蛋白激酶途徑被激活，在這個過程中核因子-κB(NFκB)被活化，產(chǎn)生了大量的細(xì)胞因子和趨化因子，促使免疫細(xì)胞的成熟，在免疫受體的表達(dá)也有非常重要的作用;可能還可以激活另外一條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路即MAPK，P38，JNK及P42/P44等信號通路，這條通路可以激活MMP-2和-9，二者是系統(tǒng)纖維蛋白溶酶激活級聯(lián)的下游目標(biāo)，通過系統(tǒng)纖維蛋白溶酶降解細(xì)胞外基質(zhì)，

4、使腫瘤進一步浸潤和轉(zhuǎn)移。
　　 目的：本研究的目的是通過檢測非小細(xì)胞肺癌的HMGB1表達(dá)水平的變化，HMGB1與腫瘤臨床生物學(xué)特性的關(guān)系，進一步探討和研究HMGB1在非小細(xì)胞肺癌中的作用及發(fā)病機制。
　　 方法：應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法檢測HMGB1在非小細(xì)胞肺癌中的mRNA的表達(dá);應(yīng)用蛋白印跡法檢測非小細(xì)胞肺癌HMGB1蛋白水平的表達(dá);比較肺癌不同分期、不同大小、手術(shù)前后HMGB1蛋白水平的變化。

5、r>　　 結(jié)果：1、RT-PCR檢測人肺癌A549細(xì)胞系、支氣管上皮細(xì)胞系HBE中HMGB1mRNA的表達(dá)結(jié)果：
　　 支氣管上皮細(xì)胞系HBE為對照細(xì)胞，根據(jù)公式2-averageΔΔCT×100％計算目的基因相對表達(dá)量。結(jié)果顯示肺腺癌A549細(xì)胞系HMGB1表達(dá)量明顯高于支氣管上皮細(xì)胞系HBE，為其11.450倍。
　　 2、人肺癌A549細(xì)胞系、支氣管上皮細(xì)胞系HBEHMGB1蛋白的表達(dá)：
　　 人肺腺癌

6、細(xì)胞株A549、支氣管上皮細(xì)胞系HBE蛋白相對表達(dá)量分別為80.44±3.51、6.83±0.75、肺癌細(xì)胞株A549HMGB1蛋白表達(dá)水平明顯高于支氣管上皮細(xì)胞系HBE，并存在統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.001)。圖2顯示兩株細(xì)胞HMGB1蛋白表達(dá)的差異。
　　 3、肺癌患者與肺良性病患者血清HMGB1蛋白的表達(dá)：
　　 145例肺癌患者血清HMGB1平均水平為76.1±37.0ng/ml，肺良性病組HMGB1平均水平為39.

7、8±10.8ng/ml)，健康志愿者HMGN1平均水平為7.7±6.1ng/ml，肺癌HMGB1表達(dá)水平明顯高于良性病患者及健康對照組，并且有統(tǒng)計學(xué)差異(p＜0.001)。
　　 4、肺癌不同分期血清HMGB1蛋白的表達(dá)：
　　 肺癌Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ及Ⅳ期患者血清HMGB1水平分別為30.2±5.9ng/ml，60.9±22.5ng/ml，99.0±23.1ng/ml及133.4±18.9ng/ml。四組間有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(

8、p＜0.0001)，并且每兩組間也有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的肺癌患者其HMGB1水平為(133.4±18.9ng/ml)明顯高于無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的肺癌患者(68.46±31.9ng/ml，p＜0.0001)。
　　 5、不同大小腫瘤血清HMGB1蛋白的表達(dá)：
　　 腫瘤長徑＞=4cm的肺癌患者，其HMGB1表達(dá)水平為105.3±28.3ng/ml，腫瘤長徑＜4cm的肺癌患者，其HMGB1表達(dá)水平為52.

9、3±23.9ng/ml，二者有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(p＜0.0001)，進一步研究結(jié)果表明血清HMGB1水平與腫瘤大小有明顯的正相關(guān)(r=0.799，p＜0.001)。
　　 6、肺癌患者術(shù)前與術(shù)后一月血清HMGB1蛋白表達(dá)：
　　 手術(shù)肺癌患者血清平均HMGB1表達(dá)水平為57.2±28.8ng/ml，術(shù)后一月患者血清平均HMGB1表達(dá)水平為26.5±14.7ng/ml，二者差異顯著(p＜0.0001)。
　　 結(jié)論

10、：
　　 我們的研究結(jié)果表明，HMGB1在非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移中有重要作用。尤為重要的是，我們的研究首次表明HMGB1的表達(dá)水平與非小細(xì)胞肺癌的臨床生物學(xué)特性有密切關(guān)系，肺癌Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ及Ⅳ期患者HMGB1平均水平逐漸增高，并且有統(tǒng)計學(xué)差異，有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的肺癌患者HMGB1水平明顯高于無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的肺癌患者。血清HMGB1水平與腫瘤大小有明顯的正相關(guān)，術(shù)后患者血清HMGB1水平明顯降低。
　　 第二部分丙酮酸乙酯對脂

11、多糖致急性肺損傷HMGB1水平的影響及意義
　　 急性肺損傷(acutelunginjury，ALI)是系統(tǒng)炎癥反應(yīng)在肺部的損害，其癥狀非常嚴(yán)重，而且病情進展極其迅速，特別容易轉(zhuǎn)為ARDS并進而發(fā)展成多器官功能衰竭。ALI是臨床上常見的危重癥之一，死亡率非常高，其臨床表現(xiàn)為頑固性低氧血癥和呼吸窘迫。
　　 探究ALI的發(fā)病原因及機制，非常錯綜復(fù)雜，一方面包括體內(nèi)因素，如促炎因素和抗炎因素的平衡問題，自身體液因素及細(xì)胞因素

12、的問題，另一方面還包括機體所處環(huán)境因素的問題。近幾年的研究結(jié)果顯示，急性肺損傷與HMGB1有非常密切的關(guān)系，HMGB1即是晚期的炎癥介導(dǎo)因子，在炎癥的發(fā)展轉(zhuǎn)歸中起著重要作用。HMGB1和炎性因子是相互作用的，一方面炎性因子受到刺激后可以釋放HMGB1，另一方面，HMGB1又可以作用于炎性因子，促使后者釋放許多炎性介質(zhì)。
　　 丙酮酸乙酯是丙酮酸親脂性的酯化物，以往作為一種化工原料，是一種重要的食品添加劑。丙酮酸乙酯是一種具有時間

13、依賴性和劑量依賴性的雙向抗炎制劑，不同時間和不同劑量的給予會產(chǎn)生不同的效果。丙酮酸乙酯可以抑制由LPS刺激的巨噬細(xì)胞釋放HMGB1，而產(chǎn)生抗炎機制。丙酮酸乙酯抑制炎癥的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是通過NF-KB來實現(xiàn)的。
　　 目的：
　　 本研究的目的是通過對丙酮酸治療脂多糖導(dǎo)致的急性肺損傷，進一步探討HMGB1在急性肺損傷發(fā)生中的作用及機制，并研究不同時間和不同劑量丙酮酸治療急性肺損傷的療效，為急性肺損傷的的治療提供新思路和新方法

14、。
　　 方法：
　　 應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)測定肺組織HMGB1mRNA表達(dá)水平；用Westernblotting法檢測肺泡灌洗液HMGB1的含量；采用ELISA法檢測腫瘤壞死因子α(TNF-α)和白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)和白介素-6(IL-6)水平。
　　 結(jié)果：
　　 1急性肺損傷及EP治療后小鼠肺組織HMGB1mRNA表達(dá)
　　 急性肺損傷時，小鼠肺組織HMGB1mR

15、NA表達(dá)明顯增高，EP治療組小鼠肺組織HMGB1mRNA表達(dá)明顯降低，二者差異顯著(P＜0.001)。
　　 2急性肺損傷及EP治療后小鼠肺組織HMGB1蛋白表達(dá)
　　 急性肺損傷時，小鼠肺組織HMGB1蛋白表達(dá)明顯增高，EP治療組小鼠肺組織HMGB1蛋白表達(dá)明顯降低，正常小鼠HMGB1蛋白表達(dá)最低，差異顯著(P＜0．001)。
　　 3急性肺損傷小鼠肺泡灌洗液炎癥因子水平變化
　　 急性肺損傷時，小鼠肺

16、泡灌洗液炎癥因子HMGB1、TNF-α、IL-6和IL-1β明顯增高，和對照組相比有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.001)；丙酮酸乙酯治療組(100mg/kg，腹腔內(nèi)注射)小鼠肺泡灌洗液炎癥因子HMGB1、TNF-α、IL-6和IL-1β明顯降低，表明丙酮酸抑制了脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷過程早期炎癥因子(TNF-α、IL-6和IL-1β)和晚期炎癥因子HMGB1的釋放，其中晚期炎癥因子HMGB1與死亡率有明顯關(guān)系。
　　 4不同劑量丙酮酸乙

17、酯對死亡率的影響
　　 高劑量丙酮酸(100mg/kg/d)治療脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷，死亡率明顯下降，與對照組相比有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.0001)；中等劑量丙酮酸(50mg/kg/d)治療脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷，也可以降低死亡率，與對照組相比有統(tǒng)計學(xué)差異(P＝0.02)；但是低劑量丙酮酸(10mg/kg/d)治療脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷，其死亡率與對照組相比無統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.81)。表明丙酮酸治療脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷，

18、其效果與劑量有明顯正相關(guān)，低劑量丙酮酸對死亡率沒有影響
　　 5不同時間丙酮酸乙酯對死亡率的影響
　　 應(yīng)用同一劑量EP（腹腔內(nèi)注射，100mg/kg/d）治療脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷，在早期應(yīng)用EP治療(0h、12h)可明顯減少小鼠死亡率，與對照組相比有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.0001)；在中期應(yīng)用EP治療(24h)可減少小鼠死亡率，與對照組相比有統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.01)；而在后期應(yīng)用EP治療(48h)，其死亡率與對照