HMGB1在肺纖維化中作用的研究.pdf

1、研究背景與目的： 特發(fā)性肺纖維化（IPF）是特發(fā)性間質(zhì)性肺疾病最常見的類型，其預(yù)后差，生存中位時(shí)間僅為3至4年。雖然目前對(duì)IPF的發(fā)病機(jī)制有一定的認(rèn)識(shí)，但對(duì)其可能的病因及確切的細(xì)胞分子機(jī)制還未明了，迄今為止尚無有效的治療手段。IPF最顯著的病理特征是成纖維細(xì)胞灶的存在。成纖維細(xì)胞灶數(shù)目的增多與IPF病程的進(jìn)展和預(yù)后不良相關(guān)。成纖維細(xì)胞灶的關(guān)鍵效應(yīng)細(xì)胞是肌纖維母細(xì)胞。表達(dá)α平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）是肌纖維母細(xì)胞區(qū)別于成纖維細(xì)胞

2、的一個(gè)標(biāo)志性特征。它能促進(jìn)纖維形成，是生成細(xì)胞外基質(zhì)和促纖維化相關(guān)細(xì)胞因子的重要來源。因此，闡明炎癥損傷與異常修復(fù)過程中α-SMA基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制，對(duì)于揭示特發(fā)性纖維化發(fā)病的細(xì)胞分子機(jī)制具有重要的意義。在前期工作中，我們應(yīng)用α-SMA啟動(dòng)子為釣餌，在博萊霉素（BLM）誘導(dǎo)肺纖維化的小鼠肺組織中篩選到一個(gè)高遷移率組蛋白B1家族（HMGBI）成員，分子量約20KDa，較之經(jīng)典的HMGB1缺失C端的30個(gè)酸性氨基酸殘基序列（GenBank登

3、陸號(hào)：BAC34367，HMGB34367），是HMGB1的截?cái)喾肿有问?。HMGB1作為核蛋白存在于幾乎所有的真核細(xì)胞中，它能夠穩(wěn)定核小體形狀，作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子具有調(diào)節(jié)某些基因轉(zhuǎn)錄活化的作用。最近的研究表明HMGB1是一種晚期炎癥因子，能被免疫細(xì)胞主動(dòng)分泌或被損傷和壞死的細(xì)胞釋放到細(xì)胞外環(huán)境，觸發(fā)炎癥反應(yīng)?；谶@些已有的發(fā)現(xiàn)，我們推測(cè)HMGB1可能是聯(lián)系IPF病理過程中肺損傷和異常修復(fù)的關(guān)鍵信號(hào)分子。為了證實(shí)這一推測(cè)，在本研究中，我們探

4、討了HMGB1以及它的截?cái)喾肿親MGB34367，在博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化病理過程中的作用，并著重探討了HMGB34367在IPF的上皮一間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化發(fā)生發(fā)展中的地位。 研究?jī)?nèi)容和方法： 第一部分：HMGB1在BLM誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠模型肺組織和IPF患者肺組織中的表達(dá)。 對(duì)BLM誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠模型肺組織和IPF患者肺組織予以常規(guī)病理學(xué)檢測(cè)，觀察病理學(xué)改變。應(yīng)用免疫組化、免疫熒光染色和western blot

5、檢測(cè)肺組織HMGB1和SMA的蛋白表達(dá)情況，檢測(cè)HMGB1在肺纖維化病理過程中的作用。 第二部分：HMGB34367 RNAi對(duì)小鼠肺纖維化病理過程的影響 給予HMGB34367 siRNA干預(yù)其在BLM誘導(dǎo)肺纖維化模型小鼠肺組織中的表達(dá)，探討HMGB1的截?cái)喾肿有问紿MGB34367蛋白是否參與了誘導(dǎo)肌纖維母細(xì)胞活化過程。首先經(jīng)氣管灌注BLM構(gòu)建肺纖維化小鼠模型，然后于實(shí)驗(yàn)第2、5、8天經(jīng)鼻滴入HMGB34367 si

6、RNA或siRNA陰性對(duì)照。實(shí)驗(yàn)第10天處死小鼠留取肺組織進(jìn)行常規(guī)病理學(xué)檢測(cè)，觀察病理學(xué)改變。應(yīng)用免疫組化、免疫熒光染色和westernblot檢測(cè)肺組織HMGB1和SMA的蛋白表達(dá)變化，探討HMGB1的高表達(dá)對(duì)肌纖維母細(xì)胞活化的影響。 第三部分：HMGB1對(duì)上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的誘導(dǎo)作用 將HMGB34367真核表達(dá)載體pcDNA3．0-HMGB34367轉(zhuǎn)染到上皮細(xì)胞16HBE中，提取細(xì)胞核蛋白，用EMSA和超遷移（Sup

7、er shift）實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HMGB34367蛋白與α-SMA啟動(dòng)子CArGB基序特異性的結(jié)合。將α-SMA啟動(dòng)子紅色熒光報(bào)告質(zhì)粒和綠色熒光標(biāo)記的HMGB34367真核表達(dá)載體質(zhì)粒（pDsRed-SMA+pEGFP-N2-HMGB34367）共轉(zhuǎn)染到上皮細(xì)胞中，通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表達(dá)紅色熒光和綠色熒光強(qiáng)度，探討過量表達(dá)HMGB34367對(duì)α-SMA啟動(dòng)子活化的影響。培養(yǎng)人肺泡上皮細(xì)胞株A549，予細(xì)胞因子混合刺激劑Mix（TGF-β1

8、+IL-1β+IFN-γ）孵育，轉(zhuǎn)染HMGB34367 siRNA干擾其在細(xì)胞中的表達(dá)，RT-PCR和免疫熒光檢測(cè)α-SMA和HMGB1基因和蛋白水平的表達(dá)。闡明炎癥微環(huán)境誘導(dǎo)內(nèi)源性HMGB1對(duì)肺纖維化病理過程的影響。 結(jié)果： 第一部分：HMGB1在BLM誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠模型肺組織和IPF患者肺組織中的的表達(dá)。 病理學(xué)觀察可見：BLM誘導(dǎo)了小鼠肺組織局灶性纖維化病變，在胸膜下區(qū)域可見肺泡間隔增厚，肺泡腔破壞，上

9、皮脫落，肺間質(zhì)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。Masson膠原染色顯示BLM組小鼠肺組織中膠原沉積明顯增多，免疫組化檢測(cè)可見肺組織HMGB1和α-SMA表達(dá)增強(qiáng)。IPF患者肺組織中也觀察到同樣的結(jié)果。IPF患者肺組織雙重免疫熒光染色揭示肺細(xì)支氣管的一些上皮細(xì)胞同時(shí)表達(dá)α-SMA和HMGB1，兩者可共定位在細(xì)胞內(nèi)同一區(qū)域。 第二部分：HMGB34367RNAi對(duì)小鼠肺纖維化病理過程的影響 組織病理學(xué)觀察表明，與BLM組和siRNA陰性對(duì)

10、照組相比，HMGB34367siRNA顯著減輕了BLM誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化損害；相應(yīng)的免疫組化結(jié)果證實(shí)肺組織中HMGB1的表達(dá)明顯下調(diào)；與此同時(shí)HMGB34367 siRNA組小鼠損傷的上皮細(xì)胞和上皮下細(xì)胞的α-SMA表達(dá)也明顯減少。Western-Blot的結(jié)果和免疫組化類似。 第三部分：HMGB1對(duì)氣道上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的誘導(dǎo)作用 EMSA和超遷移（super shif）結(jié)果顯示HMGB34367蛋白可與α-SMA啟動(dòng)子

11、CArGA基序特異性結(jié)合。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pDsRed-SMA+pEGFP-N2-HMGB34367組紅／綠色熒光相對(duì)值較對(duì)照組明顯升高。在TGF-β1刺激的條件下，前者紅/綠色熒光相對(duì)值較對(duì)照組增強(qiáng)更為明顯?；旌洗碳┱T導(dǎo)A549細(xì)胞表型向間充質(zhì)樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化，細(xì)胞內(nèi)HMGB1的表達(dá)量增多。RT-PCR結(jié)果表明，加入混合刺激劑Mix作用后刺激了A549細(xì)胞α-SMA和HMGB34367基因的表達(dá)。免疫熒光結(jié)果揭示混合刺激劑

12、處理48小時(shí)后，一些上皮細(xì)胞出現(xiàn)α-SMA的陽性表達(dá)。HMGB34367RNAi能有效降低HMGB1的表達(dá)，與此同時(shí)可見α-SMA的基因和蛋白水平的表達(dá)也相應(yīng)降低。HMGB34367 RNAi具有特異性地阻斷α-SMA的誘導(dǎo)表達(dá)能力。 結(jié)論： 1、HMGB1的誘導(dǎo)表達(dá)在肺纖維化發(fā)病過程中發(fā)揮了重要的作用。 2、HMGB34367蛋白作為HMGB1蛋白的截?cái)喾肿有问?，能夠與α-SMA啟動(dòng)子特異性結(jié)合，作為α-SMA