人類糞便中小腸結腸炎耶爾森菌檢測方法的研究.pdf

1、背景：感染性腹瀉(infectious diarrhea)由各種病原微生物及其產物或者寄生蟲所引起,不僅對人的身體健康危害較大,也嚴重影響了公共衛(wèi)生,帶來一系列社會和經濟問題。及時對感染性腹瀉致病病原體進行快速、靈敏、特異性地檢測和診斷,是科學預防和控制感染性腹瀉暴發(fā)和流行的重要保證。
　　 小腸結腸炎耶爾森菌(Yersinia enterocolitica,Y.enterocolitica)是近二十年來引起國際上廣泛關注的一種

2、重要的感染性腹瀉致病菌,大多數人類患者通過消化道受至吐感染。人類感染該菌后,主要表現為發(fā)熱、腹痛、腹瀉等急性胃腸炎的癥狀,還可引起結節(jié)性紅斑、活動性關節(jié)炎、耶氏肝炎,其他還有腦膜炎、心肌炎、虹膜炎、深部膿腫、敗血癥及創(chuàng)傷感染等腸道外癥狀,甚至還能由超抗原引起突眼性甲狀腺腫等自身免疫性疾病。目前普遍用于小腸結腸炎耶爾森菌檢測的方法有細菌分離培養(yǎng)和生化鑒定、普通PCR法、Real-time PCR法等。傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)和生化鑒定還是診斷盼“金

3、標準”,然而其敏感性不高,而且耗時耗力。以PCR法為基礎的分子生物學技術則存在實驗設備昂貴,檢測費用較高、對檢測人員技術要求較高等缺點,使其不適用于現場快速檢測和基層單位推廣普及使用。如何建立新的快速、簡便的檢測方法成為研究的熱點。
　　 環(huán)介導等溫擴增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技術是近年來新出現和新發(fā)展起來的一種敏感、特異、方便快捷的鏈置換核酸擴增技術,可作為病原

4、體所致的感染性疾病早期檢測和鑒定的一種簡單而快速的診斷工具。整個過程非常簡單而且迅速,僅需在一個反應管內加入所有反應試劑,利用針對目標基因設計的特異性LAMP引物,在恒溫的條件下即可完成。該技術已經用于多種細菌、病毒、真菌和寄生蟲的檢測,其優(yōu)勢在于等溫擴增,整個反應過程簡單,而擴增效率更高,還能保證反應的高靈敏度和特異度,通過肉眼觀察或者瓊脂糖凝膠電泳即可判定反應結果,尤其適合于病原體的現場快速檢測、戰(zhàn)時野外環(huán)境下及基層單位普及應用。<

5、br>　　 最近,有學者應用LAMP技術檢測食品中的小腸結腸炎耶爾森菌,獲得了較好的靈敏度和特異度,但是該技術能否用于糞便中小腸結腸炎耶爾森菌的檢測以及檢測效果如何,目前國內外尚無報道。
　　 此外,現有的研究顯示,絕大多數學者在進行LAMP條件優(yōu)化試驗時,習慣性地按照全面試驗法、多次單因素法依次優(yōu)化反應條件,繁瑣費時,還不一定能夠得到最佳的擴增效果,對影響LAMP反應的主要因素也未見定量分析的報道。
　　 系統(tǒng)評價(

6、Systematic review)是循證醫(yī)學的重要研究方法。它針對某一個具體的臨床或科研問題進行定性或定量分析,獲得指導臨床或者科研的最佳證據。90年代以來,國內外已發(fā)表數以千計的有關系統(tǒng)評價的論文,涉及醫(yī)學研究的各個領域,包括病因研究、診斷性試驗、防治評價、預后研究等等。迄今為止,有關普通PCR法、Real-time PCR法等核酸擴增技術檢測小腸結腸炎耶爾森菌的文獻報道較多,但未見系統(tǒng)評價用于這些檢測方法的綜合分析。
　　

7、 目的：
　　 1.對目前已有報道的主要核酸擴增技術(普通PCR法、Real-time PCR法和LAMP法)檢測小腸結腸炎耶爾森菌的研究進行系統(tǒng)評價以了解這些技術當前的檢測情況；
　　 2.建立糞便標本中的小腸結腸炎耶爾森菌的LAMP檢測方法,并將正交設計引入LAMP反應的條件優(yōu)化試驗中,進一步對影響LAMP反應的主要因素進行分析;
　　 3.對優(yōu)化的LAMP法的特異度和靈敏度等指標進行測試,并將其用于臨床糞便

8、樣本的實際檢測,同時作分離培養(yǎng)、普通PCR和熒光定量PCR平行檢測,比較不同檢測方法,對所建立LAMP法進行應用評價。
　　 方法：
　　 1.制定原始文獻的納入、排除標準及檢索策略,檢索MEDLINE、EMBASE、BIOSIS、Web of Science、Cochrane Library以及萬方學術期刊全文數據庫、維普中文期刊數據庫(華師站)、中國知網(日期1990.01.01.-2010.12.31)。納入的文獻

9、采用QUADAS(Quality assessment of Diagnostic Accuracy Studies)進行質量評價,用MetaDisc1.4軟件進行數據分析。
　　 2.針對致病性小腸結腸炎耶爾森菌特有的粘附侵襲位點基因(ail基因),利用在線軟件Primer Explorer version4設計LAMP引物。根據正交表L16(45)共進行16組處理,每組重復2次,使用直觀對比法、極差分析和方差分析來確定最佳擴

10、增反應體系,并對影響LAMP反應擴增效果的主要因素進行分析；
　　 3.利用NCBI的Blast分析比對LAMP所使用內、外引物的特異度,并對3株小腸結腸炎耶爾森菌菌株和18株非耶爾森菌其他細菌菌株進行LAMP擴增檢測所建立LAMP反應的特異度。從細菌基因組DNA、純培養(yǎng)菌落、模擬感染糞便標本三個方面對LAMP法的靈敏度進行檢測,同時作普通PCR和熒光定量PCR平行檢測與之比較。此外,同時使用分離培養(yǎng)法、普通PCR法、熒光定量P

11、CR法和LAMP法對206例腹瀉患者糞便標本和50例正常糞便標本中的致病性小腸結腸炎耶爾森菌進行檢測,比較了四種方法的檢測情況。
　　 結果：
　　 1.符合標準的共有11篇文獻,12個研究。采用隨機效應模型進行數據分析。合并后的診斷優(yōu)勢比(DOR)為458.91(95％CI:72.62-2900.09),敏感度為0.72(95％CI:0.69-0.75),特異度為0.96(95％CI:0.95-0.96),陽性似然比為

12、27.23(95％CI:10.60-69.96),陰性似然比為0.09(95％CI:0.02-0.30)。合并后的準確性測量指標均具有高度異質性(P＜0.1,I2＞50％),合并沒有意義,但不存在閾值效應所致異質性。
　　 2.針對致病性小腸結腸炎耶爾森菌特有的粘附侵襲位點基因(ail基因)成功設計了4條LAMP引物。根據正交表L16(45)完成16次試驗并重復2次后,經過直觀對比、極差分析和方差分析最終確立最佳反應體系,即在2

13、5μl反應體系中,內引物FIP、BIP各0.8μM,外引物F3、B3各0.2μM,1.0M Betaine,1.0mM dNTPs,4.0mM MgC12,8U Bst DNA聚合酶,2.5μl10×Thermopol緩沖液和5μl DNA模板。擴增程序為:60℃孵育60 min,然后80℃孵育4min。經實踐證明,該LAMP反應體系重復性好、可靠穩(wěn)定。方差分析結果顯示,本試驗條件下反應體系中五個主要因素對LAMP擴增效果影響從大到小依

14、次為:FIP/BIP、dNTPs、Mg8+、F3/B3、Betaine。
　　 3.
　　 (1)NCBI的Blast比對結果發(fā)現,研究中所設計的內引物FIP/BIP和外引物B3/F3均與小腸結腸炎耶爾森菌具有100％的同源性。采用LAMP方法對21株細菌的基因組DNA擴增,除所有的小腸結腸炎耶爾森菌檢測陽性外,其它對照細菌檢測結果均為陰性,表明該檢測方法特異度好。
　　 (2)以小腸結腸炎耶爾森菌標準菌株為試驗

15、菌株,靈敏度試驗顯示,該LAMP法最低可檢測低達約為5.3fg(電泳檢測或紫外透射儀下肉眼檢測)或53fg/25μl反應體系(自然光下肉眼檢測)小腸結腸炎耶爾森菌基因組DNA,對于細菌純培養(yǎng)物檢測極限約為1.5 CFU/ml(電泳檢測或紫外透射儀下肉眼檢測)或15 CHJ/ml(自然光下肉眼檢測),直接對糞便樣本中的小腸結腸炎耶爾森菌進行檢測的極限為15 CFU/g(電泳檢測或紫外透射儀下肉眼檢測)或150 CFU/g(自然光下肉眼檢測

16、)。與同時進行的普通PCR和Real-time PCR相比,普通PCR法與自然光下肉眼檢測LAMP結果的靈敏度一致,比電泳檢測或紫外透射儀下肉眼檢測結果的靈敏度低,Real-time PCR的最低檢測度則與電泳檢測或紫外透射儀下肉眼檢測結果一致,培養(yǎng)法需要菌液濃度達到1.5×103CFU/g才能從糞便標本中分離到細菌。即LAMP法比傳統(tǒng)PCR的靈敏度高了10倍,與Real-time PCR一致,相對細菌培養(yǎng)計數法,LAMP法的靈敏度則要

17、高出2個數量級。
　　 (3)206例腹瀉患者糞便標本LAMP檢測后,成功檢出11例樣本中含有致病性小腸結腸炎耶爾森菌,與普通PCR和Real-time PCR完全符合,但經培養(yǎng)和鑒定成功的為9例。50例正常對照者中,四種檢測方法均未檢出致病性小腸結腸炎耶爾森菌。以培養(yǎng)法為“金標準”,LAMP法的特異性為99.0％,培養(yǎng)陽性的9例樣本經LAMP法檢測也均為陽性,Youden指數為0.990。經McNemar檢驗,兩種檢測方法之間

18、的差異無顯著性(P=0.500),二者吻合度較強。(Kappa系數=0.895,P=0.000)
　　 結論：
　　 1.總的來說,普通PCR法、Real-time PCR法和LAMP法檢測小腸結腸炎耶爾森菌的診斷效能較高,可是各個研究的異質性大,測量指標敏感度(9％-100％)、特異度(37％-100％)等的變化范圍也較大,尚不能取代傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法單獨用于檢測小腸結腸炎耶爾森菌,但可以聯合傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法進行檢測,尚需進

19、行大規(guī)模的流行病學調查以評價這些核酸擴增方法。
　　 2.本研究針對致病性小腸結腸炎耶爾森菌ail基因成功建立LAMP檢測方法。經優(yōu)化的LAMP法特異度強,靈敏度高,使用恒溫水浴鍋1小時即可完成,不需要昂貴精密的儀器和特殊的試劑,可通過多種方法實現對終點產物的檢測,不同檢測方法造成檢測的靈敏度有所差異。
　　 3.該LAMP法適用于糞便樣本中小腸結腸炎耶爾森菌的檢測。糞便標本檢測的過程包括了過夜冷增菌、DNA提取以及LA

20、MP擴增和結果判定,全部步驟只需不到1天即可完成。用于實際樣本檢測時,與培養(yǎng)法、普通PCR法和Real-time PCR法顯示了良好的一致性。
　　 4.正交試驗與方差分析相結合優(yōu)化LAMP反應體系,比單因素試驗、全面試驗的方法簡單快捷,比簡單的直觀對比、極差分析更準確可靠,適用于LAMP反應體系的快速優(yōu)化。
　　 5.FIP/BIP、F3/B3、dNTPs、Mg2+、Betaine濃度對LAMP擴增效果均有影響,各因素