人類糞便中小腸結(jié)腸炎耶爾森菌檢測(cè)方法的研究.pdf

1、背景：感染性腹瀉(infectious diarrhea)由各種病原微生物及其產(chǎn)物或者寄生蟲所引起,不僅對(duì)人的身體健康危害較大,也嚴(yán)重影響了公共衛(wèi)生,帶來一系列社會(huì)和經(jīng)濟(jì)問題。及時(shí)對(duì)感染性腹瀉致病病原體進(jìn)行快速、靈敏、特異性地檢測(cè)和診斷,是科學(xué)預(yù)防和控制感染性腹瀉暴發(fā)和流行的重要保證。
　　 小腸結(jié)腸炎耶爾森菌(Yersinia enterocolitica,Y.enterocolitica)是近二十年來引起國(guó)際上廣泛關(guān)注的一種

2、重要的感染性腹瀉致病菌,大多數(shù)人類患者通過消化道受至吐感染。人類感染該菌后,主要表現(xiàn)為發(fā)熱、腹痛、腹瀉等急性胃腸炎的癥狀,還可引起結(jié)節(jié)性紅斑、活動(dòng)性關(guān)節(jié)炎、耶氏肝炎,其他還有腦膜炎、心肌炎、虹膜炎、深部膿腫、敗血癥及創(chuàng)傷感染等腸道外癥狀,甚至還能由超抗原引起突眼性甲狀腺腫等自身免疫性疾病。目前普遍用于小腸結(jié)腸炎耶爾森菌檢測(cè)的方法有細(xì)菌分離培養(yǎng)和生化鑒定、普通PCR法、Real-time PCR法等。傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)和生化鑒定還是診斷盼“金

3、標(biāo)準(zhǔn)”,然而其敏感性不高,而且耗時(shí)耗力。以PCR法為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)技術(shù)則存在實(shí)驗(yàn)設(shè)備昂貴,檢測(cè)費(fèi)用較高、對(duì)檢測(cè)人員技術(shù)要求較高等缺點(diǎn),使其不適用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)和基層單位推廣普及使用。如何建立新的快速、簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法成為研究的熱點(diǎn)。
　　 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技術(shù)是近年來新出現(xiàn)和新發(fā)展起來的一種敏感、特異、方便快捷的鏈置換核酸擴(kuò)增技術(shù),可作為病原

4、體所致的感染性疾病早期檢測(cè)和鑒定的一種簡(jiǎn)單而快速的診斷工具。整個(gè)過程非常簡(jiǎn)單而且迅速,僅需在一個(gè)反應(yīng)管內(nèi)加入所有反應(yīng)試劑,利用針對(duì)目標(biāo)基因設(shè)計(jì)的特異性LAMP引物,在恒溫的條件下即可完成。該技術(shù)已經(jīng)用于多種細(xì)菌、病毒、真菌和寄生蟲的檢測(cè),其優(yōu)勢(shì)在于等溫?cái)U(kuò)增,整個(gè)反應(yīng)過程簡(jiǎn)單,而擴(kuò)增效率更高,還能保證反應(yīng)的高靈敏度和特異度,通過肉眼觀察或者瓊脂糖凝膠電泳即可判定反應(yīng)結(jié)果,尤其適合于病原體的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)、戰(zhàn)時(shí)野外環(huán)境下及基層單位普及應(yīng)用。<

5、br>　　 最近,有學(xué)者應(yīng)用LAMP技術(shù)檢測(cè)食品中的小腸結(jié)腸炎耶爾森菌,獲得了較好的靈敏度和特異度,但是該技術(shù)能否用于糞便中小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的檢測(cè)以及檢測(cè)效果如何,目前國(guó)內(nèi)外尚無報(bào)道。
　　 此外,現(xiàn)有的研究顯示,絕大多數(shù)學(xué)者在進(jìn)行LAMP條件優(yōu)化試驗(yàn)時(shí),習(xí)慣性地按照全面試驗(yàn)法、多次單因素法依次優(yōu)化反應(yīng)條件,繁瑣費(fèi)時(shí),還不一定能夠得到最佳的擴(kuò)增效果,對(duì)影響LAMP反應(yīng)的主要因素也未見定量分析的報(bào)道。
　　 系統(tǒng)評(píng)價(jià)(

6、Systematic review)是循證醫(yī)學(xué)的重要研究方法。它針對(duì)某一個(gè)具體的臨床或科研問題進(jìn)行定性或定量分析,獲得指導(dǎo)臨床或者科研的最佳證據(jù)。90年代以來,國(guó)內(nèi)外已發(fā)表數(shù)以千計(jì)的有關(guān)系統(tǒng)評(píng)價(jià)的論文,涉及醫(yī)學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域,包括病因研究、診斷性試驗(yàn)、防治評(píng)價(jià)、預(yù)后研究等等。迄今為止,有關(guān)普通PCR法、Real-time PCR法等核酸擴(kuò)增技術(shù)檢測(cè)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的文獻(xiàn)報(bào)道較多,但未見系統(tǒng)評(píng)價(jià)用于這些檢測(cè)方法的綜合分析。
　　

7、 目的：
　　 1.對(duì)目前已有報(bào)道的主要核酸擴(kuò)增技術(shù)(普通PCR法、Real-time PCR法和LAMP法)檢測(cè)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的研究進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)價(jià)以了解這些技術(shù)當(dāng)前的檢測(cè)情況；
　　 2.建立糞便標(biāo)本中的小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的LAMP檢測(cè)方法,并將正交設(shè)計(jì)引入LAMP反應(yīng)的條件優(yōu)化試驗(yàn)中,進(jìn)一步對(duì)影響LAMP反應(yīng)的主要因素進(jìn)行分析;
　　 3.對(duì)優(yōu)化的LAMP法的特異度和靈敏度等指標(biāo)進(jìn)行測(cè)試,并將其用于臨床糞便

8、樣本的實(shí)際檢測(cè),同時(shí)作分離培養(yǎng)、普通PCR和熒光定量PCR平行檢測(cè),比較不同檢測(cè)方法,對(duì)所建立LAMP法進(jìn)行應(yīng)用評(píng)價(jià)。
　　 方法：
　　 1.制定原始文獻(xiàn)的納入、排除標(biāo)準(zhǔn)及檢索策略,檢索MEDLINE、EMBASE、BIOSIS、Web of Science、Cochrane Library以及萬方學(xué)術(shù)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù)、維普中文期刊數(shù)據(jù)庫(kù)(華師站)、中國(guó)知網(wǎng)(日期1990.01.01.-2010.12.31)。納入的文獻(xiàn)

9、采用QUADAS(Quality assessment of Diagnostic Accuracy Studies)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià),用MetaDisc1.4軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
　　 2.針對(duì)致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌特有的粘附侵襲位點(diǎn)基因(ail基因),利用在線軟件Primer Explorer version4設(shè)計(jì)LAMP引物。根據(jù)正交表L16(45)共進(jìn)行16組處理,每組重復(fù)2次,使用直觀對(duì)比法、極差分析和方差分析來確定最佳擴(kuò)

10、增反應(yīng)體系,并對(duì)影響LAMP反應(yīng)擴(kuò)增效果的主要因素進(jìn)行分析；
　　 3.利用NCBI的Blast分析比對(duì)LAMP所使用內(nèi)、外引物的特異度,并對(duì)3株小腸結(jié)腸炎耶爾森菌菌株和18株非耶爾森菌其他細(xì)菌菌株進(jìn)行LAMP擴(kuò)增檢測(cè)所建立LAMP反應(yīng)的特異度。從細(xì)菌基因組DNA、純培養(yǎng)菌落、模擬感染糞便標(biāo)本三個(gè)方面對(duì)LAMP法的靈敏度進(jìn)行檢測(cè),同時(shí)作普通PCR和熒光定量PCR平行檢測(cè)與之比較。此外,同時(shí)使用分離培養(yǎng)法、普通PCR法、熒光定量P

11、CR法和LAMP法對(duì)206例腹瀉患者糞便標(biāo)本和50例正常糞便標(biāo)本中的致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌進(jìn)行檢測(cè),比較了四種方法的檢測(cè)情況。
　　 結(jié)果：
　　 1.符合標(biāo)準(zhǔn)的共有11篇文獻(xiàn),12個(gè)研究。采用隨機(jī)效應(yīng)模型進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。合并后的診斷優(yōu)勢(shì)比(DOR)為458.91(95％CI:72.62-2900.09),敏感度為0.72(95％CI:0.69-0.75),特異度為0.96(95％CI:0.95-0.96),陽(yáng)性似然比為

12、27.23(95％CI:10.60-69.96),陰性似然比為0.09(95％CI:0.02-0.30)。合并后的準(zhǔn)確性測(cè)量指標(biāo)均具有高度異質(zhì)性(P＜0.1,I2＞50％),合并沒有意義,但不存在閾值效應(yīng)所致異質(zhì)性。
　　 2.針對(duì)致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌特有的粘附侵襲位點(diǎn)基因(ail基因)成功設(shè)計(jì)了4條LAMP引物。根據(jù)正交表L16(45)完成16次試驗(yàn)并重復(fù)2次后,經(jīng)過直觀對(duì)比、極差分析和方差分析最終確立最佳反應(yīng)體系,即在2

13、5μl反應(yīng)體系中,內(nèi)引物FIP、BIP各0.8μM,外引物F3、B3各0.2μM,1.0M Betaine,1.0mM dNTPs,4.0mM MgC12,8U Bst DNA聚合酶,2.5μl10×Thermopol緩沖液和5μl DNA模板。擴(kuò)增程序?yàn)?60℃孵育60 min,然后80℃孵育4min。經(jīng)實(shí)踐證明,該LAMP反應(yīng)體系重復(fù)性好、可靠穩(wěn)定。方差分析結(jié)果顯示,本試驗(yàn)條件下反應(yīng)體系中五個(gè)主要因素對(duì)LAMP擴(kuò)增效果影響從大到小依

14、次為:FIP/BIP、dNTPs、Mg8+、F3/B3、Betaine。
　　 3.
　　 (1)NCBI的Blast比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn),研究中所設(shè)計(jì)的內(nèi)引物FIP/BIP和外引物B3/F3均與小腸結(jié)腸炎耶爾森菌具有100％的同源性。采用LAMP方法對(duì)21株細(xì)菌的基因組DNA擴(kuò)增,除所有的小腸結(jié)腸炎耶爾森菌檢測(cè)陽(yáng)性外,其它對(duì)照細(xì)菌檢測(cè)結(jié)果均為陰性,表明該檢測(cè)方法特異度好。
　　 (2)以小腸結(jié)腸炎耶爾森菌標(biāo)準(zhǔn)菌株為試驗(yàn)

15、菌株,靈敏度試驗(yàn)顯示,該LAMP法最低可檢測(cè)低達(dá)約為5.3fg(電泳檢測(cè)或紫外透射儀下肉眼檢測(cè))或53fg/25μl反應(yīng)體系(自然光下肉眼檢測(cè))小腸結(jié)腸炎耶爾森菌基因組DNA,對(duì)于細(xì)菌純培養(yǎng)物檢測(cè)極限約為1.5 CFU/ml(電泳檢測(cè)或紫外透射儀下肉眼檢測(cè))或15 CHJ/ml(自然光下肉眼檢測(cè)),直接對(duì)糞便樣本中的小腸結(jié)腸炎耶爾森菌進(jìn)行檢測(cè)的極限為15 CFU/g(電泳檢測(cè)或紫外透射儀下肉眼檢測(cè))或150 CFU/g(自然光下肉眼檢測(cè)

16、)。與同時(shí)進(jìn)行的普通PCR和Real-time PCR相比,普通PCR法與自然光下肉眼檢測(cè)LAMP結(jié)果的靈敏度一致,比電泳檢測(cè)或紫外透射儀下肉眼檢測(cè)結(jié)果的靈敏度低,Real-time PCR的最低檢測(cè)度則與電泳檢測(cè)或紫外透射儀下肉眼檢測(cè)結(jié)果一致,培養(yǎng)法需要菌液濃度達(dá)到1.5×103CFU/g才能從糞便標(biāo)本中分離到細(xì)菌。即LAMP法比傳統(tǒng)PCR的靈敏度高了10倍,與Real-time PCR一致,相對(duì)細(xì)菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)法,LAMP法的靈敏度則要

17、高出2個(gè)數(shù)量級(jí)。
　　 (3)206例腹瀉患者糞便標(biāo)本LAMP檢測(cè)后,成功檢出11例樣本中含有致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌,與普通PCR和Real-time PCR完全符合,但經(jīng)培養(yǎng)和鑒定成功的為9例。50例正常對(duì)照者中,四種檢測(cè)方法均未檢出致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌。以培養(yǎng)法為“金標(biāo)準(zhǔn)”,LAMP法的特異性為99.0％,培養(yǎng)陽(yáng)性的9例樣本經(jīng)LAMP法檢測(cè)也均為陽(yáng)性,Youden指數(shù)為0.990。經(jīng)McNemar檢驗(yàn),兩種檢測(cè)方法之間

18、的差異無顯著性(P=0.500),二者吻合度較強(qiáng)。(Kappa系數(shù)=0.895,P=0.000)
　　 結(jié)論：
　　 1.總的來說,普通PCR法、Real-time PCR法和LAMP法檢測(cè)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的診斷效能較高,可是各個(gè)研究的異質(zhì)性大,測(cè)量指標(biāo)敏感度(9％-100％)、特異度(37％-100％)等的變化范圍也較大,尚不能取代傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法單獨(dú)用于檢測(cè)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌,但可以聯(lián)合傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法進(jìn)行檢測(cè),尚需進(jìn)

19、行大規(guī)模的流行病學(xué)調(diào)查以評(píng)價(jià)這些核酸擴(kuò)增方法。
　　 2.本研究針對(duì)致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌ail基因成功建立LAMP檢測(cè)方法。經(jīng)優(yōu)化的LAMP法特異度強(qiáng),靈敏度高,使用恒溫水浴鍋1小時(shí)即可完成,不需要昂貴精密的儀器和特殊的試劑,可通過多種方法實(shí)現(xiàn)對(duì)終點(diǎn)產(chǎn)物的檢測(cè),不同檢測(cè)方法造成檢測(cè)的靈敏度有所差異。
　　 3.該LAMP法適用于糞便樣本中小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的檢測(cè)。糞便標(biāo)本檢測(cè)的過程包括了過夜冷增菌、DNA提取以及LA

20、MP擴(kuò)增和結(jié)果判定,全部步驟只需不到1天即可完成。用于實(shí)際樣本檢測(cè)時(shí),與培養(yǎng)法、普通PCR法和Real-time PCR法顯示了良好的一致性。
　　 4.正交試驗(yàn)與方差分析相結(jié)合優(yōu)化LAMP反應(yīng)體系,比單因素試驗(yàn)、全面試驗(yàn)的方法簡(jiǎn)單快捷,比簡(jiǎn)單的直觀對(duì)比、極差分析更準(zhǔn)確可靠,適用于LAMP反應(yīng)體系的快速優(yōu)化。
　　 5.FIP/BIP、F3/B3、dNTPs、Mg2+、Betaine濃度對(duì)LAMP擴(kuò)增效果均有影響,各因素