建立環(huán)介導(dǎo)等溫擴增方法檢測腹瀉患者中的小腸結(jié)腸結(jié)腸炎耶爾森菌.pdf

1、背景:
　　 小腸結(jié)腸炎耶爾森菌（Yersinia enterocolitica，Y.enterocolitica），是近20世紀80年代以來引起國際上廣泛關(guān)注的一種重要的感染性腹瀉致病菌，于1933年在美國紐約州發(fā)現(xiàn)后，曾引起數(shù)次大規(guī)模的胃腸道內(nèi)或和胃腸道外感染爆發(fā)。上個世紀80年代中期，我國曾發(fā)生2次大爆發(fā)，造成500多人感染。
　　 小腸結(jié)腸炎耶爾森菌是一種全球分布的食源性病原菌，可引起人類多種腸道癥狀，如腹瀉、腸

2、炎、腸系膜淋巴結(jié)炎以及末端回腸炎，以自限性疾病為主;還可通過淋巴系統(tǒng)播散，引起一系列腸道外并發(fā)癥狀，包括反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎、結(jié)節(jié)性紅斑、心內(nèi)膜炎，敗血癥等，不僅對人類身體健康產(chǎn)生較大危害，也嚴重影響了公共衛(wèi)生，給人類以及社會帶來較大的經(jīng)濟以及醫(yī)療負擔。目前國內(nèi)醫(yī)院尚未把小腸結(jié)腸炎耶爾森菌列入常規(guī)的檢測項目中，醫(yī)務(wù)人員普遍缺乏對本菌的認識，臨床醫(yī)生在對胃腸道疾病進行診斷時也很少考慮小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的感染，人們可能低估了該菌感染的真實情況。

3、r>　　 目前普遍用于小腸結(jié)腸炎耶爾森菌檢測的方法有傳統(tǒng)的細菌分離培養(yǎng)和生化鑒定、普通PCR法、Real-time PCR法等。傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)和生化鑒定對污染樣本進行檢測時都需要經(jīng)過前期的增菌，然后再進行分離培養(yǎng)和十幾項的生化鑒定，而該菌的致病數(shù)量低，培養(yǎng)增殖緩慢，分離成功率低，敏感性不高，耗時耗力，還可能耽誤臨床感染患者抗生素的使用。以PCR法為基礎(chǔ)的核酸擴增技術(shù)則需要昂貴的實驗設(shè)備，較高的檢測費用、結(jié)果判斷繁瑣，對檢測人員技術(shù)要求

4、較高等，這些特點使其不適用于現(xiàn)場快速檢測和基層單位推廣普及使用。尋找一種新的快速、簡便、廉價的檢測方法成為研究的熱點。
　　 環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技術(shù)是近十年來發(fā)展起來的一種新型的敏感、特異、方便快捷的體外恒溫鏈置換基因擴增技術(shù)，針對靶基因的6個區(qū)域設(shè)計2對特異性引物，利用具有鏈置換活性的DNA聚合酶，在恒溫條件下，特異、高效、快速地進行擴增，1

5、小時內(nèi)擴增效率可達到109-1010拷貝的數(shù)量級，終點產(chǎn)物檢測通過肉眼觀察即可。由于其經(jīng)濟、快速、實用而逐步應(yīng)用在生命科學(xué)的各個領(lǐng)域如:病原體及其耐藥性診斷、基因診斷與治療、胚胎性別鑒定、食品衛(wèi)生檢驗和環(huán)境監(jiān)測等?？勺鳛椴≡w所致疾病早期檢測和鑒定的一種簡單而快速的診斷方法，在對條件較差的基層單位，現(xiàn)場，戰(zhàn)時野外環(huán)境，災(zāi)后地區(qū)病原體的現(xiàn)場快速檢測有著廣闊的應(yīng)用前景。
　　 此外，查閱文獻發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)有研究中絕大多數(shù)學(xué)者在進行LAMP

6、條件優(yōu)化試驗時，習(xí)慣性地對試驗體系的影響因素進行逐一單因素優(yōu)化，繁瑣費時，存在較大的盲目性，而且得到的單因素最佳擴增效果組合在一起不一定是最佳的反應(yīng)組合。有學(xué)者利用正交設(shè)計進行LAMP反應(yīng)條件優(yōu)化，正交設(shè)計能成倍地減少試驗次數(shù)，但是也要注意，正交設(shè)計之所以能成倍減少試驗次數(shù)，是以犧牲分析各因素的部分或大部分交互作用為代價的，且正交設(shè)計表設(shè)計較為麻煩。
　　 析因設(shè)計（也稱全因子實驗設(shè)計），即實驗中涉及所有因素及所有水平全面組合形

7、成實驗條件，各實驗條件下至少做2次獨立重復(fù)實驗。析因設(shè)計是對各因素不同水平的全部組合，故具有全面性和均衡性。析因設(shè)計的最大優(yōu)點是所獲得的信息量很多，可以準確地估計各實驗因素的主效應(yīng)的大小，還可估計因素之間各級交互作用效應(yīng)的大小。自從著名的英國統(tǒng)計學(xué)家Fisher于20世紀30年代創(chuàng)立析因設(shè)計并首次將其應(yīng)用在農(nóng)業(yè)試驗中，試驗設(shè)計方法至今已經(jīng)得到了充分的發(fā)展和廣泛的應(yīng)用，在工業(yè)、醫(yī)藥以及科學(xué)實驗等各個方面均有其蹤跡。
　　 目的：<

8、br>　　 1.建立糞便樣本中的小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的LAMP檢測方法，將析因設(shè)計引入LAMP反應(yīng)的條件優(yōu)化試驗中，并對影響LAMP反應(yīng)的主要因素作進一步分析;
　　 2.對優(yōu)化后確定的LAMP最佳反應(yīng)體系進行特異度和靈敏度等指標的測試，并將其應(yīng)用于臨床腹瀉樣本的實際檢測，同時聯(lián)合普通PCR做平行檢測，對所建立的LAMP方法的實際應(yīng)用效果進行評價。
　　 方法：
　　 1.參考文獻設(shè)計的LAMP引物，把影響LAM

9、P反應(yīng)的主要因素FIP/BIP、MgCl2、dNTPs作為優(yōu)化對象，每個因素設(shè)定4個水平，建立4×4×4三因素析因設(shè)計表，根據(jù)設(shè)計表共進行64組處理，每組重復(fù)2次，對128組LAMP終點產(chǎn)物進行OD400測定，把測定的數(shù)值錄入SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計分析，使用描述性分析和方差分析結(jié)果以及多重比較來確定最佳擴增反應(yīng)體系，并對影響LAMP反應(yīng)擴增效果的因素順序進行分析;
　　 2.使用純菌落DNA提取試劑盒和糞便DNA提取試劑盒

10、分別對不同樣本進行DNA提取，對小腸結(jié)腸炎耶爾森菌標準株和11株非小腸結(jié)腸炎耶爾森菌菌株進行LAMP擴增，檢測所建立的LAMP反應(yīng)體系的特異度。從小腸結(jié)腸炎耶爾森菌基因組DNA、純培養(yǎng)菌落、模擬感染糞便樣本三個方面對所建立的LAMP法進行靈敏度檢測。
　　 3.收集廣州市某社區(qū)醫(yī)院和某二甲醫(yī)院的腹瀉病人糞便樣本，并對樣本進行前處理和過夜冷增菌處理，提取過夜冷增菌液的DNA，使用普通PCR法和優(yōu)化后的LAMP法對收集回來的臨床腹瀉

11、患者糞便樣本中的小腸結(jié)腸炎耶爾森菌進行檢測，并對檢測陽性的冷增菌液標本進行細菌培養(yǎng)與鑒定。比較普通PCR法和LAMP法的檢測情況。
　　 結(jié)果：
　　 1.參照文獻設(shè)計的4條LAMP引物，根據(jù)4×4×4三因素析因設(shè)計表完成了64次試驗并重復(fù)2次，根據(jù)OD400值通過描述性分析、方差分析和各因素的多重比較確定FIP/BIP、MgCl2、dNTPs的最適合組合:FIP/BIP各1.6μM，dNTPs為1.6 mM，MgCl2

12、為2.0mM。最終的LAMP最佳反應(yīng)體系，即在25μl反應(yīng)體系中， FIP/BIP各1.6μM，F(xiàn)3/B3各0.2μM，1.6 mM dNTPs，2.0mM MgCl2，8UBst DNA聚合酶，2.5μl10×Thermopol緩沖液和5μl DNA模板。擴增程序為:63℃孵育60 min，然后80℃孵育10min。經(jīng)實驗證明，該LAMP反應(yīng)體系重復(fù)性好、可靠穩(wěn)定。方差分析結(jié)果顯示，F(xiàn)IP/BIP、MgCl2、dNTPs三因素存在交互

13、效應(yīng)，各因素之間互相影響，不是單獨存在的。本試驗條件下反應(yīng)體系中3個主要因素對LAMP擴增效果影響從大到小依次為:FIP/BIP、Mg2+、dNTPs。
　　 2.對小腸結(jié)腸炎耶爾森菌以及11株非小腸結(jié)腸炎耶爾森菌進行LAMP擴增，僅小腸結(jié)腸炎耶爾森菌出現(xiàn)陽性結(jié)果，其余11株非小腸結(jié)腸炎耶爾森菌均為陰性，表明所建立的LAMP方法特異性好。以小腸結(jié)腸炎耶爾森菌標準菌株為試驗菌株，結(jié)果用肉眼以及紫外透視儀兩種方法結(jié)合觀察，靈檢出限顯

14、示，該LAMP法對小腸結(jié)腸炎耶爾森菌基因組DNA最低可檢測濃度約為38.05fg/μl;對于細菌純培養(yǎng)物檢測極限約為15CFU/ml;直接對糞便樣本中的小腸結(jié)腸炎耶爾森菌進行檢測限為150CFU/g。
　　 3.收集廣州市某社區(qū)醫(yī)院和某二甲醫(yī)院的腹瀉病人糞便樣本539例，對539例腹瀉患者糞便標本進行LAMP檢測后，成功檢出13例樣本中含有小腸結(jié)腸炎耶爾森菌，普通PCR檢出11例。取13例陽性樣本的冷增菌液進行分離培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，普通

15、PCR檢出的11例陽性樣本均能培養(yǎng)出小腸結(jié)腸炎耶爾森菌，LAMP法比PCR多檢出的2例陽性樣本不能培養(yǎng)出小腸結(jié)腸炎耶爾森菌。以普通PCR為“金標準”，LAMP法的靈敏度為100％，特異度為99.62％，Youden指數(shù)為0.99，陽性預(yù)測值0.846，陰性預(yù)測值1.00，且與PCR法顯示了較好的一致性（McNemar檢驗P=0.500; Kappa=0.915，P=0.000）。
　　 結(jié)論：
　　 1.析因設(shè)計試驗與方

16、差分析相結(jié)合優(yōu)化LAMP反應(yīng)體系，比單因素逐一試驗的方法科學(xué)可靠，適用于LAMP反應(yīng)體系的快速優(yōu)化。
　　 2.本研究參考文獻針對小腸結(jié)腸炎耶爾森菌16S rDNA-23S rDNA間區(qū)序列設(shè)計的引物，對LAMP中的FIP/BIP、MgCl2、dNTPs三因素實現(xiàn)了成功優(yōu)化。經(jīng)優(yōu)化的LAMP法特異度強，靈敏度高，快速簡便，在恒溫水浴鍋中敷浴l小時便可完成，不需要昂貴精密的儀器和繁瑣的結(jié)果判斷，通過肉眼觀察即可實現(xiàn)對擴增產(chǎn)物的檢測

17、。
　　 3.收集回來的腹瀉標本進行LAMP法檢測的過程包括過夜冷增菌、DNA提取以及LAMP法擴增和結(jié)果判定，全部步驟不到1天便可完成，高效、快速。對腹瀉樣本進行檢測時，LAMP法與普通PCR法顯示了良好的一致性。所建立的LAMP法適用于腹瀉樣本中小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的檢測。
　　 4.FIP/BIP、dNTPs、Mg2+對LAMP擴增效果均有影響，三者之間存在交互效應(yīng)，使用析因分析確定LAMP最佳反應(yīng)體系，更準確更合理