小腸結(jié)腸炎耶爾森菌非特異性核酸酶的結(jié)構(gòu)分析及定點(diǎn)突變研究.pdf

1、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌（Yersinia enterocolitica subsp.palearctica（Y.e.p））核酸酶是一種非特異性核酸酶，可以降解各種DNA和RNA，無(wú)論是單鏈、雙鏈、線狀、環(huán)狀還是超螺旋形式，而且對(duì)核酸的序列沒(méi)有要求。本實(shí)驗(yàn)室前期成功克隆了Y.e.p核酸酶的編碼基因nuc，構(gòu)建了重組表達(dá)載體pET24a-nuc，利用IPTG誘導(dǎo)獲得重組核酸酶，研究了其酶學(xué)性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)重組核酸酶不僅具有酶活性高的優(yōu)點(diǎn)，而且還具有超

2、級(jí)耐高溫、耐酸堿及耐化學(xué)物質(zhì)等特點(diǎn)。為闡明該酶具有優(yōu)良性能的原因，本論文通過(guò)生物信息學(xué)分析和定點(diǎn)突變的方法研究影響Y.e.p非特異性核酸酶酶活和熱穩(wěn)定性的因素，為進(jìn)一步研究Y.e.p非特異性核酸酶的功能進(jìn)化奠定基礎(chǔ)。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴用生物學(xué)軟件全面分析Y.e.p非特異性核酸酶的一級(jí)結(jié)構(gòu)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)域和三級(jí)結(jié)構(gòu)，為Y.e.p非特異性核酸酶的定點(diǎn)突變研究提供理論基礎(chǔ)。⑵通過(guò)對(duì)Y.e.p非特異性核酸酶活性位點(diǎn)、鹽橋和二硫

3、鍵定點(diǎn)突變的研究，改變活性位點(diǎn)氨基酸、破壞鹽橋和二硫鍵組成，發(fā)現(xiàn)Y.e.p非特異性核酸酶酶活和熱穩(wěn)定性急劇下降，說(shuō)明活性位點(diǎn)對(duì)維持Y.e.p非特異性核酸酶的酶活，鹽橋和二硫鍵對(duì)維持Y.e.p非特異性核酸酶的熱穩(wěn)定性具有重要作用。⑶序列比對(duì)熱不穩(wěn)定Y.e.e非特異性核酸酶和熱穩(wěn)定Y.e.p非特異性核酸酶，對(duì)差異氨基酸進(jìn)行定點(diǎn)突變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)E202A，I203F，D264E這三個(gè)位點(diǎn)氨基酸的改變能引起酶活及熱穩(wěn)定性變化，由此推測(cè)Glu202