酶抑制反應動力學過程分析的應用.pdf

1、第一部分以Candidasp．尿酸酶為模型考察用積分法測定米氏常數(Michaelis-Mentenconstant，Km)及黃嘌呤對其抑制常數(inhibitionconstant，Ki)所需條件。用293nm吸收變化記錄尿酸酶反應，用積分法確定表觀米氏常數(apparentMichaelis-Mentenconstant，Kmapp)和表觀最大反應速度(apparentmaximalreactionrate，Vmapp)。據上述參數

2、隨抑制劑濃度的變化確定抑制類型和Ki。被分析數據中的畸異值顯著降低結果可靠性。通常終點底物濃度小于1／6Kmapp而起始底物濃度足夠高，此積分法測定Kmapp的偏差和變異小于20％而Vmapp精度更高。用積分法所得Kmapp與雙倒數法一致，且和黃嘌呤濃度成正比，對應Ki為(5．4±0．8)μmol／L(n=3)，也與雙倒數法一致。被分析數據精度足夠高，用無抑制劑~l'Km的4倍以上起始底物濃度，并固定終點底物濃度小于1／6Km，此積分法

3、能高效且低成本篩選特殊類型的抑制劑。 第二部分以Bacillusfastidiosus胞外尿酸酶為模型考察用簡化積分法測定較低底物濃度測定黃嘌呤Ki的可靠性。用簡化積分速度方程擬合反應過程確定Vm／Km，據Km／Vm隨黃嘌呤濃度的變化確定Ki，同時用測定半抑制濃度法測定黃嘌呤對其Ki。兩種方法所得結果均與雙倒數法無統(tǒng)計差異，但簡化積分法成本低，抗干擾能力更強。在實踐中對于已知抑制類型抑制劑及其類似物，可據定量方法靈敏度與Km的

4、相對大小選擇測定抑制效力的方法；反應不可逆且可連續(xù)監(jiān)測反應曲線時，在較低底物濃度下用簡化積分法篩選抑制劑更便于常規(guī)實踐。 第三部分以谷胱甘肽-S-轉硫酶(glutathione-S-transferase,GST)為模型，考察用積分法測定有產物抑制的不可逆酶反應體系底物含量的可靠性，及積分法結合經典初速度法測定酶活性的可靠性。測定340am吸收監(jiān)測反應。優(yōu)化參數后此積分法所得產物最大吸收和酶活性對分析數據起止點的變化不敏感，且

5、有很寬的線性響應范圍。故只要獲得不可逆酶反應體系積分速度方程和有效參數，有產物抑制時此積分法仍能用于動力學酶法分析和測定酶活性。積分法結合經典初速度法測定酶活性可有效拓展線性響應范圍。用積分法進行動力學酶法分析方法效率高，成本低，抗干擾能力強，上限高于工具酶Km，甚至可高于儀器可測上限。此積分法用于酶法分析具有一定普遍性和應用價值。 第四部分以酵母醇脫氫酶(Dehydrogenases,ADH)為模型，考察用積分法測定有產物抑