穿膜肽攜帶的目的蛋白穿膜效應(yīng)的研究.pdf

1、生物大分子在許多疾病的治療中發(fā)揮著重要作用，如超氧化物岐化酶(SOD)和過氧化物酶(CAT)、VEGF、糖尿病特效藥胰島素、抑癌基因表達的抑制腫瘤細胞生長或促進腫瘤細胞凋亡的抑瘤蛋白p53、p27等。由于細胞膜的天然屏障作用，只有分子量小于600Da的小分子化合物、非極性疏水性的、脂溶性的，或細胞膜上有其載體的有機物才能穿透細胞膜進入細胞內(nèi)。使得這類有治療價值但無細胞膜穿透性且易降解的親水性分子在細胞生物學(xué)、藥學(xué)等研究領(lǐng)域中的應(yīng)用大大受

2、到限制。多年來，研究人員致力于探索將這些效應(yīng)分子導(dǎo)入活細胞的有效方法。常用的方法有電穿孔、顯微注射、改變大分子物質(zhì)的物理和化學(xué)性狀、基因轉(zhuǎn)染、顆粒(如脂質(zhì)體)包裹法和細胞融合技術(shù)等。盡管這些方法各有優(yōu)勢，但都存在著操作復(fù)雜、效率不高和難于調(diào)控等問題。 近年來，相繼發(fā)現(xiàn)了一些具有細胞穿透功能的氨基酸序列，長度為幾個至幾十個氨基酸不等，多數(shù)小于20個氨基酸，被命名細胞穿膜肽(cell-penetratingpeptides，CPPs

3、)。細胞穿膜肽也被稱之為蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域(proteintransductiondomain,PTD)，或Trojanhorsepeptides，可以有效地將蛋白、多肽、核酸片段通過無受體介導(dǎo)、無耗能的方式，導(dǎo)入多種哺乳動物細胞，且在一定濃度范圍內(nèi)不會造成細胞損傷。CPPs的發(fā)現(xiàn)為生物大分子用于疾病治療帶來了曙光，在細胞生物學(xué)、基因治療、藥物體內(nèi)轉(zhuǎn)運、臨床藥效評價及細胞免疫學(xué)等研究領(lǐng)域均具有良好的應(yīng)用前景。細胞穿膜肽有天然存在和人工合成兩大類

4、，細胞穿膜肽的研究始于1988年，Green和Frankel分別證實HIV-1的反式激活蛋白Tat能跨膜轉(zhuǎn)移入細胞質(zhì)和細胞核內(nèi)。1997年，Vives等發(fā)現(xiàn)HIV-TAT中一個富含堿性氨基酸、帶正電荷的多肽片斷與蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)功能密切相關(guān)天然存在的CPPs。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的有三種，分別來自果蠅同源異型域ANTP、單純皰疹病毒1型(HSV-1)VP22轉(zhuǎn)錄因子以及HIV-1和SIV(2，3)的Tat。這些細胞穿膜肽均為帶有正電荷的長短不等的多肽片

5、段，其中富含精氨酸、賴氨酸等堿性氨基酸殘基。利用這一特性，人工合成的多聚精氨酸、賴氨酸，也具有穿膜活性，且9個精氨酸和9個賴氨酸殘基構(gòu)成的基序比TatPTD的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)活性還要強。經(jīng)過對天然存在的CPPs的結(jié)構(gòu)研究Morris小組設(shè)計合成了21個氨基酸殘基的兼性肽段PEP-1(KETWWETWWTEWSQPKKKRKV)，PEP-1不同于天然CPPs，無需共價鍵與目的大分子相連即可發(fā)揮轉(zhuǎn)運外源大分子的作用，可以轉(zhuǎn)運天然構(gòu)像蛋白高效進入細胞

6、，這大大改善了以往的CPPs只能高效轉(zhuǎn)運變性蛋白的缺憾。綠色熒光蛋白(Greenfluorescenceprotein，GFP)由238個氨基酸組成，分子量為27kD，在395nm波長光的激發(fā)下可以發(fā)射出明亮的綠色熒光，它的表達沒有種屬特異性，不需要輔助因子、底物或其他基因表達產(chǎn)物的協(xié)助，靈敏度高。在多數(shù)細胞GFP發(fā)出的熒光可以均勻地充滿胞漿、細胞核和諸如軸突的遠端突起。GFP在活細胞、組織或器官中無需任何處理即可在熒光顯微鏡下直接觀察

7、，加之動物體內(nèi)不產(chǎn)生內(nèi)源性GFP，它是活細胞的理想標(biāo)記物，可以在熒光顯微鏡下直接對活體細胞進行研究。由于其熒光穩(wěn)定、檢測方便、對活細胞無傷害等，已被作為報告蛋白在檢測目的基因表達、研究細胞內(nèi)物質(zhì)代謝及追蹤細胞系的分化等方面被廣泛應(yīng)用。增強型綠色熒光蛋白(Enhancedgreenfluorescenceprotein，EGFP)是GFP的突變體，是由GFP的第64、65位的苯丙氨酸和絲氨酸分別置換成亮氨酸和蘇氨酸而形成[23]，EGFP

8、在480nm波長的激發(fā)下可以發(fā)射出比GFP亮35倍的綠色熒光，使得其觀察和檢測更為方便靈敏。 p27基因是Polyak等于1994年發(fā)現(xiàn)的一種抑癌基因，其在腫瘤發(fā)生發(fā)展和治療方面的作用正不斷被發(fā)現(xiàn)。正常情況下p27基因在G0/G1期表達增高，當(dāng)細胞進入s期表達下降。p27基因編碼的P27蛋白是細胞周期蛋白依賴激酶抑制因子(CKIs)，是細胞周期的負(fù)調(diào)控因子，能作用于整個細胞周期，廣泛抑制各種細胞周期素和CDK的活性，具有負(fù)調(diào)控細

9、胞周期進程、參與細胞分化的調(diào)控、誘導(dǎo)細胞凋亡等作用。除此之外P27還可調(diào)節(jié)實體瘤的耐藥性，防止炎癥對機體的損傷。P27被廣泛應(yīng)用于各種腫瘤如消化道腫瘤、乳腺癌、肺癌、宮頸癌等治療的試驗研究，P27的降解主要由泛素介導(dǎo)的187位蘇氨酸磷酸化引起，半衰期較短(約2h)，在體內(nèi)不穩(wěn)定，因此p27kip1被稱為“短壽蛋白”。 第一部分：TAT-EGFP融合蛋白對小鼠生物膜穿透性的研究 人工合成編碼HIV-TATPTD11個氨基酸

10、的雙鏈寡核苷酸片段，PCR擴增目的基因EGFP，分子克隆常規(guī)操作構(gòu)建pET28a-TAT-EGFP重組表達載體，轉(zhuǎn)導(dǎo)入宿主菌BL21后用IPTG誘導(dǎo)TAT-EGFP融合蛋白表達，經(jīng)鎳金屬鰲合層析柱純化獲得融合蛋白。通過腹腔注射到小鼠體內(nèi)，觀察TAT-EGFP融合蛋白穿透各組織生物膜及達到各組織的時間、濃度。研究發(fā)現(xiàn)腹腔注射TAT-EGFP，30min后各主要臟器經(jīng)檢測均有熒光出現(xiàn)，4h各組織熒光強度達最大值。研究證明HIV-1TAT-P

11、TD與EGFP形成的融合蛋白可穿透包括腦組織在內(nèi)的所有生物膜。 第二部分PEP-1-EGFP穿透性研究 人工合成編碼PEP-121個氨基酸的兩條寡核苷酸片段，PCR擴增目的基因EGFP，利用T/A克隆，構(gòu)建pGEM-T-EGFP重組質(zhì)粒，分子克隆常規(guī)操作構(gòu)建pET15b-pep-1-EGFP重組表達載體，轉(zhuǎn)導(dǎo)入宿主菌E.coliBL21(DE3)，IPTG誘導(dǎo)PEP-1-EGFP融合蛋白表達，經(jīng)鎳金屬鰲合層析柱純化獲得融

12、合蛋白。在體外培養(yǎng)細胞及小鼠體內(nèi)研究融合蛋白的穿透性。實驗證明pGEM-TEasy載體的使用使基因克隆過程更加簡便容易，構(gòu)建更加準(zhǔn)確無誤。EGFP的N端加上PEP-1這一人工合成的CPPs形成的融合蛋白，可以無需經(jīng)過復(fù)雜的變性復(fù)性過程，直接以天然有活性的形式穿透體外培養(yǎng)細胞及小鼠各組織器官。這一研究為使用更加安全有效的穿膜肽奠定了良好的實驗基礎(chǔ)，為使用天然構(gòu)像的EGFP研究活細胞結(jié)構(gòu)、功能提供了一個良好的報告蛋白。 第三部分：P

13、EP-1-P27mt的穿透性研究 人工合成編碼細胞穿膜肽PEP-121個氨基酸的雙鏈寡核苷酸片段，構(gòu)建pET15b-pep-1-p27mt重組表達子，轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coliBL21(DE3)pLysS宿主菌，IPTG誘導(dǎo)，高效表達可溶性PEP-1-P27mt融合蛋白，利用表達蛋白N端的組氨酸“標(biāo)簽”，Ni2+-金屬鰲合樹脂親和層析柱純化目的蛋白，SDS-PAGE分析和Westernblot鑒定純化目的蛋白。在體外培養(yǎng)的食管癌E

14、C9706細胞加入不同濃度的PEP-1-P27mt并作用不同時間，免疫熒光觀察加入PEP-1-P27mt10min培養(yǎng)細胞即出現(xiàn)熒光染色，2h染色光密度達到最高峰，PEP-1-P27mt終濃度為1nmol/L促細胞凋亡作用最強。SD大鼠腹腔注射PEP-1-P27mt后，免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)30min各主要臟器均有熒光出現(xiàn)，4h各組織熒光強度達最大值。 第一部分：TAT-EGFP融合蛋白對小鼠生物膜穿透性的研究 目的探討TAT

15、-EGFP融合蛋白穿透生物膜的效應(yīng)，為臨床上應(yīng)用生物大分子藥物進入組織細胞內(nèi)發(fā)揮治療作用提供實驗基礎(chǔ)。結(jié)論在生物大分子的N-末端加上TAT具有穿透力的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)肽段形成的融合蛋白可有效穿透細胞膜到達各組織。 第二部分PEP-1-EGFP穿透性研究 人工合成編碼PEP-121個氨基酸的兩條寡核苷酸片段，PCR擴增目的基因EGFP，利用T/A克隆，構(gòu)建pGEM-T-EGFP重組質(zhì)粒，分子克隆常規(guī)操作構(gòu)建pET15b-pep-

16、1-EGFP重組表達載體，轉(zhuǎn)導(dǎo)入宿主菌E.coliBL21(DE3)，IPTG誘導(dǎo)PEP-1-EGFP融合蛋白表達，經(jīng)鎳金屬鰲合層析柱純化獲得融合蛋白。在體外培養(yǎng)細胞及小鼠體內(nèi)研究PEP-1-EGFP融合蛋白的穿透性。 第三部分PEP-1-P27mt的穿透性研究 人工合成編碼細胞穿膜肽PEP-121個氨基酸的雙鏈寡核苷酸鏈，構(gòu)建pET15b-pep-1-p27mt重組表達子，轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coliBL21(DE3)pL

17、ysS宿主菌，IPTG誘導(dǎo)，高效表達可溶性PEP-1-P27mt融合蛋白，利用表達蛋白N端的組氨酸“標(biāo)簽”，Ni2+-金屬鰲合樹脂親和層析柱純化目的蛋白，SDS-PAGE分析和Westernblot鑒定純化目的蛋白。在體外培養(yǎng)的食管癌EC9706細胞加入不同濃度的PEP-1-P27mt并作用不同時間，免疫熒光觀察加入PEP-1-P27mt10min培養(yǎng)細胞即出現(xiàn)熒光染色，2h染色光密度達到最高峰，PEP-1-P27mt終濃度為1mmol

18、/L促細胞凋亡作用最強。SD大鼠腹腔注射PEP-1-P27mt后，免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)30min各主要臟器均有熒光出現(xiàn)，4h各組織熒光強度達最大值。實驗證明PEP-1能有效攜帶P27mt進入培養(yǎng)細胞，為應(yīng)用細胞周期抑制蛋白誘導(dǎo)腫瘤細胞調(diào)亡提供了一種新的生物學(xué)方法。 經(jīng)過對天然存在的細胞穿膜肽的生物化學(xué)性質(zhì)研究，已經(jīng)逐漸掌握了細胞穿膜肽的一些共有特性，這類物質(zhì)均為帶有正電荷的長短不等的多肽片段，其中富含精氨酸、賴氨酸等堿性氨基酸殘基，