穿膜肽TAT與bFGF的融合表達(dá)及其對增生性瘢痕的治療作用.pdf

1、目的:用基因克隆技術(shù)構(gòu)建出穿膜肽bFGF重組載體，然后在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)并純化出有活性以及細(xì)胞穿透能力的融合蛋白。通過對日本大白兔耳朵打孔制做出兔耳增生性瘢痕模型，然后分析融合蛋白對增生性瘢痕是否產(chǎn)生療效。最后進(jìn)一步探究融合蛋白在治療兔耳增生性瘢痕模型產(chǎn)生治療效果的基本機(jī)理。
　　方法:通過兩步PCR的方法克隆出穿膜肽TAT與重組人成纖維細(xì)胞因子(rhbFGF)基因序列，經(jīng)過限制性內(nèi)切酶酶切相同的酶切位點(diǎn)，然后利用T4

2、DNA連接酶進(jìn)行連接，從而構(gòu)建出pET3c-TAT-rhbFGF重組載體。將重組轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)中進(jìn)行擴(kuò)增、鑒定?；驕y序后，將序列正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌表達(dá)菌株中進(jìn)行蛋白表達(dá)。在大腸桿菌生長到對數(shù)生長期用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。經(jīng)過SDS-PA6E及Western blot鑒定后，融合蛋白以可溶性方式存在。采用弱陽離子交換色譜和親和層析對融合蛋白純化，純化后用3T3細(xì)胞增殖能力檢測融合蛋白的生物活性，用HFF細(xì)胞內(nèi)部熒光

3、強(qiáng)度檢測融合蛋白的細(xì)胞穿透能力。將融合蛋白制備成凝膠劑型后，對小鼠背部局部給藥，檢測融合蛋白的皮膚穿透能力。利用打孔器對日本大白兔耳朵腹側(cè)進(jìn)行打孔，去除皮膚及軟骨膜，然后放入到普通級飼養(yǎng)室飼養(yǎng)。兔兒增生性瘢痕形成以后，將瘢痕組織隨機(jī)分為3組，分別為空白對照組、bFGF給藥組、融合蛋白給藥組。每天給藥一次，連續(xù)給藥30天。平均每十天收取一批瘢痕組織，并對其進(jìn)行包埋切片處理。治療結(jié)束后，主要針對融合蛋白對瘢痕模型的厚度、成纖維細(xì)胞密度、瘢痕

4、組織中Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白含量的影響進(jìn)行了分析。最后，本研究對融合蛋白治療效果的機(jī)制進(jìn)行了初步探究。
　　結(jié)果:1、采用兩步PCR法獲得了全長的TAT-rhbFGF融合蛋白基因序列，經(jīng)過酶切與連接后得到pET3c-TAT-rhbFGF重組質(zhì)粒。
　　2、在大批量的篩菌實(shí)驗(yàn)后，確定了融合蛋白在37℃、200rpm/min下培養(yǎng)，并且在對數(shù)生長期進(jìn)行誘導(dǎo)的最佳條件，我們得到了融合蛋白表達(dá)量高的宿主菌。中式發(fā)酵后收集菌體，破碎離心后

5、對所得上清和沉淀分別進(jìn)行SDS-PAGE，結(jié)果顯示融合蛋白主要存在于上清液中，屬于可溶性蛋白。經(jīng)過CM弱陽離子柱純化后，大部分雜蛋白被分離出去;然后經(jīng)過肝素親和層析，獲得了純度在90％以上的融合蛋白。Western Blot實(shí)驗(yàn)顯示，融合蛋白在理論的條帶位置顯色，融合蛋白得到正確表達(dá)。NIH3T3細(xì)胞的促有絲分裂實(shí)驗(yàn)中，融合蛋白也顯示出了較高的促增殖活性。細(xì)胞穿透能力檢測發(fā)現(xiàn)，相對于對照組，融合蛋白更容易快速、大量的穿透細(xì)胞膜進(jìn)入到細(xì)胞

6、中。
　　3、通過優(yōu)化卡波姆凝膠的制作工藝，我們制備出的凝膠無色透明，均勻細(xì)膩，看不到明顯的不溶物，并且在常溫下一直處于膠狀，不出現(xiàn)干涸或液化。融合蛋白透皮能力檢測中，與rhbFGF相比，融合蛋白具有較強(qiáng)的皮膚屏障穿透能力，能夠穿透皮膚表面進(jìn)入到皮下組織。
　　4、在增生性瘢痕治療研究中，治療組中兔耳增生性瘢痕與治療前相比，瘢痕的厚度減小，中間突出的小疙瘩消失，瘢痕趨于平坦，顏色由深紅變?yōu)闇\紅。H&E染色發(fā)現(xiàn)，治療后，瘢痕組

7、織中成纖維細(xì)胞的密度也明顯降低，細(xì)胞的排列也趨于整齊。與空白對照組相比，治療后，瘢痕組織中Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白含量明顯降低，接近于正常皮膚水平。在給藥后，細(xì)胞凋亡檢測發(fā)現(xiàn)，融合蛋白治療組中成纖維細(xì)胞凋亡明顯增多，而在對照組和bFGF給藥組中幾乎看不到凋亡的細(xì)胞。
　　結(jié)論:1、構(gòu)建完整的pET3c-TAT-rhbFGF重組質(zhì)粒，并在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中得到了正確、高效的表達(dá)。得到了純度較高的具有促增殖能力的、能夠穿透細(xì)胞膜的融合蛋白。