狂犬病毒糖蛋白衍生肽作為新型穿膜肽攜帶熒光素酶的入腦研究.pdf

1、目前,神經(jīng)退行性疾病、腦卒中和腦癌這些疾病相當(dāng)難治療的原因在于許多藥物無(wú)法穿過(guò)血腦屏障(blood-brain barrier,BBB),特別是一些已經(jīng)明確了對(duì)腦細(xì)胞具有神經(jīng)保護(hù)作用的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子更是無(wú)法通過(guò)BBB。腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain-derired neurotrophic factor,BDNF)已經(jīng)證實(shí)能夠減少神經(jīng)元的正常死亡,促進(jìn)海馬神經(jīng)元,皮層神經(jīng)元的修復(fù)和再生,但是其自身卻難以通過(guò)血腦屏障。
　　 是否有

2、一種穿膜肽(cell penetrating peptides,CPPs)既能夠進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)也能作為載體運(yùn)載大分子蛋白入腦呢?狂犬病毒糖蛋白(rabies virusglycoprotein)已被證實(shí)具有攜帶siRNA及EGFP等大分子穿過(guò)血腦屏障的能力。
　　 將狂犬病毒糖蛋白衍生肽(peptides derived from rabies virusglycoprotein,RDP)用羅丹明B標(biāo)記,通過(guò)尾靜脈注射入小鼠體

3、內(nèi),分別于15min,5h頸椎脫臼處死小鼠,取腦、脊髓、心、肝、脾等組織,冷凍切片,通過(guò)熒光顯微鏡觀察羅丹明B標(biāo)記的RDP在不同時(shí)間點(diǎn)的體內(nèi)分布。
　　 選取狂犬病毒糖蛋白衍生肽189和330多肽片段的基因序列,通過(guò)分子克隆的方法,將RDPl89和RDP330的核酸片段分別與螢火蟲熒光素酶(FireflyLuciferase)基因序列重組,得到RDP189-luc,RDP330-luc的重組基因,同時(shí)構(gòu)建沒(méi)有RDP的熒光素酶重組

4、質(zhì)粒,作為對(duì)照。獲得的陽(yáng)性克隆,轉(zhuǎn)入BL21大腸桿菌菌株后,加入終濃度為1.0 mM/L的IPTG在16℃,210r/m誘導(dǎo)6h,利用超聲破碎的方法,離心獲得目的蛋白,通過(guò)SDS-PAGE凝膠電泳檢測(cè)融合蛋白為可溶性表達(dá),并計(jì)算目的蛋白表達(dá)量。
　　 Folin-酚法測(cè)總蛋白含量,熒光素酶檢測(cè)試劑盒檢測(cè)目的蛋白的活性后通過(guò)尾靜脈注射方法為小鼠給藥。隨機(jī)將健康昆明小鼠分為四組:第一組為空白對(duì)照組,注射生理鹽水;第二組注射不含RDP

5、的重組熒光素酶;第三組注射含有RDP189-luc的重組蛋白;第四組注射RDP330-luc的重組蛋白。15min,30min,1h,5h處死小鼠,取中樞神經(jīng)組織,勻漿后檢測(cè)熒光素酶活性及蛋白含量。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,尾靜脈給藥15min后,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中觀察到羅丹明B標(biāo)記的RDP片段發(fā)出的紅光,分布于神經(jīng)元細(xì)胞與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞,而在外周組織中的分布與對(duì)照組相似,這說(shuō)明RDP能夠透過(guò)血腦屏障快速入腦,并且主要分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)

6、。
　　 在RDP攜帶熒光素酶入腦實(shí)驗(yàn)中,15min時(shí)已在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中均檢測(cè)到較高的熒光素酶活性,這說(shuō)明RDP能夠快速的通過(guò)血腦屏障,具有很強(qiáng)的嗜神經(jīng)性,RDP330肽段攜帶熒光素酶活性海馬區(qū)高于皮層,而RDP189融合蛋白活性皮層高于海馬區(qū)。5h后熒光素酶活性與對(duì)照組相似,說(shuō)明融合蛋白能夠快速被生物體降解,具有很高的生物安全性。通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明RDP能夠攜帶熒光素酶這種蛋白大分子快速入腦,不同的RDP融合蛋白在腦內(nèi)的分布