穿膜肽介導(dǎo)的眼內(nèi)基因遞送系統(tǒng).pdf

1、眼內(nèi)新生血管性疾病是一類眼部的高發(fā)病變，可引起包括老年黃斑變性、糖尿病性黃斑水腫等致盲性眼部疾病。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelialgrowth factor，VEGF)在眼內(nèi)新生血管性疾病的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用，成為主要的治療靶點(diǎn)之一。目前臨床上采用整合素、單克隆抗體、適配體及干擾RNA等藥物拮抗VEGF，起到抑制新生血管形成的作用。這類治療用生物大分子由于分子量大、親水性強(qiáng)，通過滴眼的方式給藥很難吸收到達(dá)

2、眼后段，必須采用玻璃體內(nèi)注射給藥，導(dǎo)致患者順應(yīng)性差。因此,如何改善此類藥物通過非損傷途徑給藥的眼部吸收是藥劑學(xué)工作者關(guān)注的焦點(diǎn)。
　　細(xì)胞穿膜肽(cell-penetrating peptides，CPPs)是一類具有穿透細(xì)胞膜能力的短肽，一般由不超過30個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，分子整體帶正電荷。CPP以非受體依賴方式穿過細(xì)胞膜，轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高且不易造成細(xì)胞損傷。目前常用的CPPs有TAT（轉(zhuǎn)錄蛋白反式作用子）、聚精氨酸、穿膜素（penet

3、ratin或transportan）等，利用這些CPPs已成功地將蛋白質(zhì)、核酸、納米粒、脂質(zhì)體等多種生物大分子或納米制劑遞送到細(xì)胞中。
　　本文旨在從目前研究較成熟的穿膜肽中篩選出一種眼部透過性及安全性良好的穿膜肽。并構(gòu)建一種CPPs介導(dǎo)的非損傷性眼部基因遞送系統(tǒng)，改善基因藥物經(jīng)由結(jié)膜囊內(nèi)給藥在眼后段的吸收，取代目前常用的玻璃體內(nèi)注射的給藥方法，提高患者順應(yīng)性，為實(shí)現(xiàn)生物活性大分子藥物的眼部遞送提供新途徑。
　　本文第一部分

4、針對Penetratin、Protamine、TAT、Poly(arginine)8四種備選穿膜肽及電中性的Poly(serine)8對照肽展開了體內(nèi)外評價(jià)。采用結(jié)膜細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)、家兔離體角膜透過性實(shí)驗(yàn)和大鼠在體結(jié)膜囊內(nèi)給藥觀測眼內(nèi)分布等一系列評價(jià)方法，系統(tǒng)地對CPPs的眼部透過性進(jìn)行研究。我們發(fā)現(xiàn)，在四種備選穿膜肽中，Penetratin具有最強(qiáng)的眼部透過性及安全性，細(xì)胞攝取量是對照肽Poly(serine)8的16～2

5、9倍，離體角膜表觀透過系數(shù)達(dá)到對照肽的87.5倍;結(jié)膜囊內(nèi)給藥能夠快速吸收，且在眼后段廣泛分布。采用圓二色譜對四種穿膜肽的構(gòu)象進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，Penetratin的眼部透過性與其兩親性及獨(dú)特的脯氨酸二型螺旋構(gòu)型有關(guān)。此外，選取了與備選穿膜肽氨基酸序列相同的D構(gòu)型穿膜肽進(jìn)行比較研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)構(gòu)型發(fā)生轉(zhuǎn)換后穿膜肽的眼部透過性減弱，因而確定了L構(gòu)型的Penetratin作為下一步研究中采用的優(yōu)選穿膜肽分了。
　　本文第二部分采用紅色熒光蛋

6、白質(zhì)粒(pRFP)、低分子量分枝狀陽離子聚合物（Low molecular weight Branched Cationic Polymer，LBCP)與穿膜肽Penetratin(P)設(shè)計(jì)并制備了兩種不同結(jié)構(gòu)的物理復(fù)合物pRFP/P與pRFP/LBCP/P，采用靜電結(jié)合方式壓縮報(bào)告基因，并對其進(jìn)行了處方篩選、結(jié)構(gòu)確證和理化性狀表征。優(yōu)化得到兩種物理復(fù)合物的基本處方:復(fù)合物pRFP/P處方中Penetratin與pRFP的電荷比為20∶

7、1;復(fù)合物pRFP/LBCP/P中LBCP與pRFP的氮磷比為5∶1，Penetratin與pRFP的電荷比為20∶1。采用超濾離心法對復(fù)合物的形成進(jìn)行了驗(yàn)證。兩種復(fù)合物pRFP/P與pRFP/LBCP/P的粒徑分別在400nm和100～200 nm左右，其中PAMAM參與形成的處方粒徑小于其他各組，顯示出更強(qiáng)的基因壓縮效果和結(jié)合穿膜肽的能力。透射電鏡實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)各組物理復(fù)合物的外觀圓整均一，顆粒大小與粒徑測定結(jié)果相符。
　　本文

8、第三部分針對前文制備優(yōu)化得到的復(fù)合物處方進(jìn)行了體內(nèi)外多水平的系統(tǒng)評價(jià)，采用人結(jié)膜細(xì)胞與角膜細(xì)胞作為體外模型對各組復(fù)合物進(jìn)行了體外轉(zhuǎn)染效率的定性定量考察、細(xì)胞攝取機(jī)理探究等相關(guān)研究。篩選得到了用于眼部基因遞送的最優(yōu)處方:pRFP/P20及pRFP/PAMAM/P20+ PAMAM5。大鼠在體結(jié)膜囊內(nèi)給藥實(shí)驗(yàn)證實(shí)，二者在眼內(nèi)均可達(dá)到較好的轉(zhuǎn)染效果。眼部藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明兩種復(fù)合物經(jīng)滴眼給藥可以快速吸收入眼，并且在眼后段滯留時(shí)間長達(dá)8h以上。