大蒜轉(zhuǎn)錄組測序及核因子YB3的功能研究.pdf

1、大蒜(Allium sativumL.)為百合科(Liliacaea)蔥屬(Allium)植物，栽培歷史悠久。大蒜的基因組龐大，是所有真核生物中基因組最大的物種之一。大蒜是遺傳研究和基因組信息相對缺乏的物種。目前在公共數(shù)據(jù)庫中可以利用的基因組信息非常有限。大蒜鱗莖具有自然的生理休眠特性，該特性對大蒜生產(chǎn)及產(chǎn)品貯藏有重要影響。大蒜鱗莖收獲后，在自然條件下經(jīng)歷60d-80d的休眠期，即可解除休眠，鱗芽開始萌動，伴隨著一系列的物質(zhì)代謝活動，導(dǎo)

2、致大蒜鱗莖水分及各營養(yǎng)組分含量下降，品質(zhì)降低。因此，大蒜萌發(fā)特性與大蒜產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展密切相關(guān)。核因子Y(Nuclear factor Y)是一類重要的轉(zhuǎn)錄因子，可以與CCAAT框結(jié)合并控制基因的表達，廣泛分布于酵母、哺乳動物及植物細(xì)胞中。核因子Y由三個不同的亞基組成:NF-YA、NF-YB和NF-YC。NF-YB是植物發(fā)育調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的一個關(guān)鍵樞紐，但是到目前為止對其表達調(diào)控的了解還相當(dāng)有限。
　　 本研究利用高通量測序技術(shù)對大蒜

3、的轉(zhuǎn)錄組進行了測序。對萌發(fā)期和休眠期的差異表達基因進行了分析?？寺〉玫搅舜笏庵械腘F-YB3基因，對其表達模式和功能進行了分析。主要結(jié)果如下:
　　 (1)利用Illumina高通量測序技術(shù)對大蒜休眠鱗芽和萌發(fā)鱗芽的轉(zhuǎn)錄組進行測序，得到26，666，668條90bp的序列。測序所得的Clean reads經(jīng)組裝軟件SOAPdenovo組裝成了Unigene。對休眠芽測序后得到75，226個Unigene，對萌發(fā)芽測序后得到81，

4、126個Unigene。對所得到的Unigene進一步序列拼接和去冗余處理后得到了非冗余Unigene127，933個，序列長度從200bp到2300bp，其中長度大于500bp的有33，568條。
　　 (2)通過blastx將Unigene序列比對到蛋白數(shù)據(jù)庫nr、Swiss-Prot、KEGG和COG(evalue＜0.00001)，共有45，284條unigene獲得了基因注釋。其中45，286個unigenes在nr蛋

5、白數(shù)據(jù)庫中獲得注釋，29，514個unigenes在Swiss-Prot蛋白數(shù)據(jù)庫中獲得注釋。
　　 (3)根據(jù)nr注釋信息獲得了unigene的GO分類信息。13，325條unigene歸入生物學(xué)過程(biological process)，22，845條unigene歸入細(xì)胞組分(cellular component)，10，526條unigene歸入分子功能(molecular function)。在GO分類體系中分子功能

6、、生物學(xué)過程和細(xì)胞組分3個大的類別被劃分為更詳細(xì)的45個小的類別，這一分類結(jié)果顯示了大蒜鱗莖基因表達譜的總體情況。
　　 (4)將Unigene與COG數(shù)據(jù)庫進行了比對，21，952個Unigene在COG數(shù)據(jù)庫中獲得了功能分類。3，164個Unigene被歸為R類(transcription)，占總數(shù)的14.41％。1，888個Unigene被歸為K類(general function prediction only)，占總數(shù)

7、的14.41％。1，877個Unigene被歸為K類(general function prediction only)，占總數(shù)的14.41％。
　　 (5)根據(jù)KEGG注釋信息得到了Unigene的Pathway注釋。有20，706條Unigene歸屬到125個具體的生化途徑中。在代謝途徑(metabolic pathways)中獲得注釋的Unigene數(shù)量最多，有5206個，占25.14％。其次為剪接體(Spliceosom

8、e)，有1329個Unigene，占6.42％。第三大類為植物與病原物的互作，有1458個Unigene，占5.86％。
　　 (6)在休眠期和萌發(fā)期大蒜鱗芽中共得到45，362個差異表達基因，其中在萌發(fā)期上調(diào)表達的有22，836個，下調(diào)表達的有22，526個。7784個Unigene只在萌發(fā)期表達，7975個Unigene只在休眠期表達。在休眠鱗芽中熱激蛋白，分子伴侶和逆境相關(guān)基因所占比例最大。在萌發(fā)期上調(diào)表達的基因中碳水化合

9、物代謝、轉(zhuǎn)錄、膜轉(zhuǎn)運、細(xì)胞分裂和生長的基因所占比例最大。
　　 (7)從大蒜中分離出AsNF-YB3基因，AsNF-YB3基因的開放閱讀框為633 bp，編碼211個氨基酸。序列分析表明，該基因所編碼的蛋白質(zhì)中含有典型NF-YB結(jié)構(gòu)域。與GenBank中注冊的NF-YB基因高度同源，屬于NF-YB家族的基因。AsNF-YB3基因在大蒜根、鱗莖、葉、蒜苔、花中均有表達，不具有器官特異性。AsNF-YB3基因的表達量與內(nèi)芽萌發(fā)密切相

10、關(guān)，AsNF-YB3在大蒜內(nèi)芽萌發(fā)中起重要作用。
　　 (8)構(gòu)建了真核表達載體AsNF-YB3，將表達載體轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌，利用葉盤法轉(zhuǎn)化煙草，得到了轉(zhuǎn)基因煙草植株。構(gòu)建了原核表達載體AsNF-YB3，并在大腸桿菌BL21中表達融合蛋白，免疫小白鼠，制備抗體。Western雜交表明，轉(zhuǎn)基因植株中AsNF-YB3基因已在蛋白水平過量表達。轉(zhuǎn)AsNF-YB3基因延長了種子的休眠期。過表達AsNF-YB3基因促進了幼苗主根的伸長。過表達