轉(zhuǎn)錄因子Arx出核機(jī)理的研究.pdf

1、同源異型蛋白是一類含有同源異型結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，它們控制著細(xì)胞的增殖、分化與凋亡等過(guò)程，在胚胎發(fā)育過(guò)程中對(duì)組織和器官的形成具有重要的調(diào)控作用。同源異型蛋白一般需要在細(xì)胞核中發(fā)揮其調(diào)控作用，但近期的研究發(fā)現(xiàn)它同時(shí)也受到核質(zhì)分布變化的影響，Arx(Aristaless related homeobox protein)蛋白作為paired-like型同源異型轉(zhuǎn)錄因子在前腦，睪丸，胰腺和肌肉組織中均有表達(dá)且對(duì)其發(fā)育進(jìn)程具有重要的調(diào)控作用。Ar

2、x蛋白包含兩個(gè)核定位序列，由importinα/β復(fù)合體識(shí)別NLS1和importinβ家族蛋白(importinβ1，importin9，importin13)識(shí)別NLS2而介導(dǎo)Arx入核。前期研究結(jié)果表明Arx在小鼠成肌細(xì)胞C2C12分化過(guò)程中存在出核現(xiàn)象，并證實(shí)了Arx為一個(gè)核質(zhì)穿梭蛋白及其酸性氨基酸結(jié)構(gòu)域(a.a.200-250)對(duì)于Arx出核的關(guān)鍵性作用，然而關(guān)于Arx蛋白的出核機(jī)理尚未清楚。
　　 在本研究中，我們重

3、復(fù)實(shí)驗(yàn)證實(shí)Arx在C2C12細(xì)胞分化過(guò)程中的出核現(xiàn)象，并用海馬神經(jīng)元細(xì)胞HT22進(jìn)一步驗(yàn)證同源異型轉(zhuǎn)錄因子Arx在細(xì)胞分化過(guò)程中能夠出核，即在未分化的細(xì)胞中，內(nèi)源Arx主要分布在細(xì)胞核中，當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入分化狀態(tài)時(shí)，Arx逐漸出核并主要分布在細(xì)胞質(zhì)中。在前期研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，應(yīng)用GST-pull down和免疫共沉淀(co-immunoprecipetation assay)技術(shù)，驗(yàn)證了Arx蛋白需要依賴于RanGTP的存在而與importi

4、nβ家族成員之一的CAS蛋白相互作用而形成三聚復(fù)合體;在體外出核實(shí)驗(yàn)中，用毛地黃皂苷(digitonin)處理以通透化細(xì)胞，外源添加能量重生系統(tǒng)與出核運(yùn)載載體證實(shí)了CAS蛋白是Arx的出核受體;經(jīng)RNA干擾技術(shù)沉默C2C12細(xì)胞中內(nèi)源CAS基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在60％以上分化的細(xì)胞中Arx定位于細(xì)胞核中，證實(shí)了細(xì)胞內(nèi)Arx的出核也是由CAS介導(dǎo)的，同時(shí)通過(guò)檢測(cè)C2C12細(xì)胞的分化指標(biāo):MyHC和myogenin，發(fā)現(xiàn)Arx滯留在細(xì)胞核中導(dǎo)致