地中海貧血鐵過載GDF-15基因多態(tài)性及血清糖蛋白糖基化修飾的研究和意義.pdf

1、第—部分、GDF-15基因多態(tài)性與地中海貧血鐵過載發(fā)病風險相關性研究
　　背景和目的：GDF-15表達與地中海貧血鐵過載發(fā)生、發(fā)展及治療等方面有關，本部分研究GDF-15基因rs1058587，rs1059369和rs4808793單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點在地中海貧血鐵過載患者及健康人群中的基因分布及頻率，探討rs1058587，rs1059369和rs4808793位點基因多態(tài)性與地中海貧血鐵過載遺傳易感性的關系，從基因水平

2、為地中海貧血鐵過載的發(fā)病機制及治療等方面研究提供實驗基礎。
　　方法:收集來自廣西地區(qū)的地中海貧血鐵過載患者122例，無鐵過載患者162例，選取128例健康體檢者作為對照組。采用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)技術檢測GDF-15基因rs1058587，rs1059369和rs4808793位點在病例組與對照組的基因分布頻率，用DNA測序法測定對應基因序列，以Hardy-Weinberg平衡(HWE)定律檢驗

3、納入病例的群體代表性及可比性。SNP等位基因及基因型的分布差異用x2檢驗統(tǒng)計，SNP多態(tài)性與地中海貧血鐵過載發(fā)病風險的關系用logistic回歸方法分析。
　　結(jié)果:三組在性別和年齡構(gòu)成上無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)，具有可比性。經(jīng)HWE定律檢驗，rs1059369和rs4808793兩個位點P值均大于0.05，說明所選的樣本具有群體代表性，而rs1058587位點P值小于0.001，未通過HWE平衡檢驗。rs1059369位點三

4、組間的基因型分布差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）;對照組等位基因分布頻率較鐵過載組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），無鐵過載組較對照組及鐵過載組等位基因分布頻率均無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）;鐵過載患者AA及AT基因型頻率較正常組和無鐵過載組顯著增加，地中海貧血鐵過載的發(fā)病風險增加(OR=2.297，95％CI=1.158-3.1014，P=0.002);攜帶A基因型的個體患鐵過載的風險增加(OR=2.259，95％CI=1.177-3

5、.031，P=0.003);對顯性模型及隱性模型進一步分析，等位基因A攜帶頻率(AA+AT)在對照組、無鐵過載組及鐵過載組逐漸升高，有顯著性差異(P=0.005)，增加鐵過載的發(fā)病風險(OR=2.553，95％CI=1.177-3.031，P=0.003)。rs4808793位點對照組與無鐵過載組及鐵過載組的基因型分布差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);兩個實驗組基因型分布頻率總體無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），對照組等位基因分布頻率較無鐵

6、過載組及鐵過載組總體差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），兩個實驗組等位基因分布頻率總體無統(tǒng)計學差異(P＞0.05);鐵過載患者CC及CG基因型頻率較正常組和地無鐵過載組顯著增加，地中海貧血鐵過載的發(fā)病風險增加（OR=1.295，95％CI=0.557-1.631，P=0.005）;攜帶CC基因型的個體患鐵過載的風險增加（OR=1.275，95％CI=0.658-1.589，P=0.016）;對顯性模型及隱性模型進一步分析，可看到等位基因C

7、攜帶頻率(CC+CG)在對照組、無鐵過載組及鐵過載組逐漸升高，有顯著性差異(P=0.013)，增加鐵過載的發(fā)病風險（OR=1.159，95％CI=0.797-1.359，P=0.553）。
　　結(jié)論: GDF-15基因多態(tài)位點rs1058587存在GG、CG基因型，以CG型為主，而未發(fā)現(xiàn)CC基因型，極有可能是廣西地區(qū)人群的突變型等位基因頻率極低，檢測標本量較小，不足以檢測到突變純合子個體。GDF-15基因多態(tài)位點rs1059369

8、及rs4808793的多態(tài)性與地中海貧血及鐵過載存在一定相關性，但rs4808793的多態(tài)性與地中海貧血鐵過載相關性無統(tǒng)計學意義。
　　第二部分、GDF-15 SNP基因型與血清GDF-15、EPO、Hepc及鐵代謝相關性的研究
　　背景和目的: GDF-15具有調(diào)節(jié)Hepc的作用，是鐵代謝和紅系生成中拘調(diào)節(jié)因子。地中海貧血患者，尤其是重癥患者血清中的GDF-15水平明顯高于正常人群，這表明GDF-15與地中海貧血鐵過載的發(fā)

9、生發(fā)展密切相關，但GDF-15在地中海貧血鐵過載中的機制及它對預后的影響仍不清楚，其循環(huán)水平及其基因型與地中海貧血鐵過載的關系尚不明確，其與地中海貧血鐵過載病變嚴重程度的關系對闡明鐵過載的作用機制至關重要。因此本項目研究GDF-15在地中海貧血中的水平、與鐵代謝的相關性，希望能發(fā)現(xiàn)GDF-15與鐵過載的關系，為鐵過載的診斷增加檢測指標。
　　方法:疾病組:選取2016年8月至2017年2月廣西醫(yī)科大學血液內(nèi)科受地貧之家就診的284

10、例地中海貧血患者，其中鐵過載組122例，無鐵過載組162例，男123例，女161例，年齡為0-60歲之間，地中海貧血鐵過載入選病例診斷均符合張之南《血液病診斷及療效標準》第三版及《鐵過載診斷與治療的中國專家共識》。地中海貧血鐵過載組中依賴性輸血患者68例，非依賴性輸血患者54例，所有病例均來自廣西地區(qū)，排除合并其它類型貧血、感染性疾病、腫瘤、肝臟及骨疾病等病史。對照組:同期廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院的健康體檢者128例，男性54例，女74

11、例，均排除貧血、炎癥、腫瘤等病史，納入標準:血清鐵蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白水平處于正常參考區(qū)間，常規(guī)檢查正常者。檢測血清中GDF-15、EPO、Hepc、FER、TrF水平并用WB驗證。
　　結(jié)果:經(jīng)檢驗，對照組、地中海貧血無鐵過載組和地中海貧血鐵過載組的血清Hb、GDF-15、EPO、Hepc、FER、TrF、Hepc/FER均有顯著性差異(P＜0.05)。地中海貧血鐵過載組根據(jù)是否依賴輸血分層分為依賴輸血組和非依賴輸血組，兩組間的血清H

12、b、GDF-15、EPO、Hepc、FER、TrF、Hepc/FER均有顯著性差異，差異有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。分析GDF-15水平與Hb、EPO、Hepc、FER、TrF等指標的相關性，發(fā)現(xiàn)所有研究對象血清中GDF-15水平與EPO、Hepc、FER等水平成分呈正相關(P＜0.001)，而與Hb、TrF水平、Hepc/FER比值呈負相關(P＜0.001)。GDF-15在地中海貧血患者中急劇升高，與GDF-15基因rs105936

13、9和rs4808793位點基因型及等位基因分布頻率的改變無相關性，與Hb水平呈負相關。
　　結(jié)論:
　　1.地中海貧血患者GDF-15水平隨著Hb水平的降低而升高，提示地中海貧血患者GDF-15水平升高與貧血及缺氧有關;
　　2.地中海貧血患者GDF-15水平急劇升高與GDF-15基因多態(tài)位點rs1059369及rs4808793的多態(tài)性無相關性;
　　3.較GDF-15、Hepc，Hepc/FER是一個更準確更

14、優(yōu)良的診斷鐵過載的檢測指標。
　　第三部分、地中海貧血鐵過載血清糖蛋白糖譜差異研究及意義分析
　　背景和目的:鐵過載可以引起多種臟器功能損害，涉及地中海貧血進展、療效及預后。蛋白質(zhì)糖基化修飾是一種常見的翻譯后修飾，在免疫細胞粘附、信號傳導、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、受體構(gòu)成、細胞分化發(fā)育及免疫調(diào)控等方面均有重要作用。本部分研究應用凝集素集合芯片技術對地中海貧血鐵過載患者血清樣本進行分析，旨在研究其糖蛋白糖譜特征性變化，篩選地中海貧血鐵過載診

15、斷及活動分期相關特征性糖譜標志，為進一步診療研究提供思路及基礎。
　　方法:實驗主要包含以下步驟:(1)血清低豐度蛋白的收集:等體積混合4組（α地中海貧血鐵過載組、α地中海貧血組無鐵過載組、β地中海貧血鐵過載組和β地中海貧血無鐵過載組）患者血清，使用高豐度蛋白去除柱收集血清低豐度蛋白;(2)將收集的低豐度蛋白經(jīng)除鹽、超濾、測定濃度后處理為待標記緩沖液;(3)待測低豐度蛋白CY5標記;(4)凝集素芯片的點制及芯片的雜交;(5)芯片掃

16、描、數(shù)據(jù)提取;(6)數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用SPSS16.0，符合正態(tài)分布且方差齊的數(shù)據(jù)采用兩獨立樣本的均數(shù)t檢驗，方差不齊者采用非參數(shù)秩和檢驗。(7)凝集素印跡技術檢測AAL、LCA和WGA三種凝集素對血清糖蛋白的親和能力，驗證凝集素芯片結(jié)果的可靠性。
　　結(jié)果：本次研究中4組樣品中共篩選出34種有統(tǒng)計學差異的凝集素陽性親和信號，其中α地中海貧血篩選出19個差異性凝集素和β地中海貧血篩選出15個差異性凝集素。α地中海貧血鐵過載組對AAL、L

17、CA、ABL、AMA、MNA-M、DBA、GHA、GSL1、GSL1b4、HAL、GSL2、GNL、PHA-L、PSA、SSA和LAL凝集素的親和力增強，而對RCA60、STL和WGA凝集素的親和力減弱;β地中海貧血鐵過載組對ABL、GSL2、LCA、STL、TL、AMA、PSA的親和作用增強，而對ConA、GNL、NPL、IRA、HAL、HPL、DSA、MAL-Ⅱ的親和力減弱。凝集素印跡技術證明AAL、LCA和WGA三種凝集素對血清糖