SNFYMPL 熒光探針結(jié)合共聚焦激光顯微內(nèi)鏡在胃癌診斷中的應(yīng)用.pdf

1、背景:
　　近年來，胃癌在世界范圍內(nèi)的發(fā)病率明顯降低，但仍然是患病率第五位和死亡率第三的腫瘤，東亞地區(qū)更是胃癌的高發(fā)地區(qū)。早診斷和早治療是提高胃癌病人生存率的關(guān)鍵手段。普通白光內(nèi)鏡診斷早期胃癌較為困難，對(duì)內(nèi)鏡醫(yī)生的經(jīng)驗(yàn)要求較高。CLE是近年來興起的新型內(nèi)鏡檢查技術(shù)，在診斷胃腸道粘膜微小病變上具有明顯優(yōu)勢(shì)，CLE與分子探針結(jié)合(mCLE)實(shí)現(xiàn)特定靶分子的成像，可以在在體情況下檢測(cè)分子表型的異常。目前，相關(guān)研究使用的探針一般為熒光標(biāo)記

2、的抗體和短肽，相比抗體，熒光標(biāo)記的短肽探針，具有諸多優(yōu)點(diǎn)。線性七肽SNFYMPL是通過噬菌體展示技術(shù)和全細(xì)胞差減法，用Barrett食管組織篩選出的新型靶向肽。研究表明，該靶向肽可通過連接片段標(biāo)記熒光分子成為熒光探針，短肽熒光探針可以特異性結(jié)合食管腺癌細(xì)胞系OE33。熒光探針孵育離體組織，表明探針與高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變食管粘膜選擇性結(jié)合，親和性明顯高于鱗狀上皮和腸化生組織，具備在黏膜局部發(fā)現(xiàn)食管腺癌及其癌前病變的能力。
　　由于胃癌和

3、食管腺癌有著相似的組織來源和疾病演變過程，SNFYMPL制作的熒光探針用于胃癌診斷成為可能。前期工作中，我們對(duì)該短肽與胃癌細(xì)胞的結(jié)合能力做了初步檢測(cè)，該短肽同樣可以與胃癌細(xì)胞系結(jié)合，但其在體內(nèi)外胃癌細(xì)胞上結(jié)合的特異性以及潛在的人體應(yīng)用價(jià)值尚不明確。
　　目的:
　　1、合成熒光探針SNF*-FITC，并驗(yàn)證其與胃癌細(xì)胞系的結(jié)合能力；
　　2、驗(yàn)證熒光探針SNF*-FITC與胃癌組織的結(jié)合能力。
　　方法:

4、　　1、合成熒光探針SNF*-FITC，并驗(yàn)證與胃癌細(xì)胞系的結(jié)合能力。
　　(1)在試劑公司協(xié)助下，從頭合成熒光探針，使用HPLC和 ESI-MS等技術(shù)純化鑒定成品質(zhì)量；
　　(2)使用熒光探針SNF*-FITC對(duì)兩種胃癌細(xì)胞系進(jìn)行熒光染色，使用共聚焦顯微鏡觀察熒光強(qiáng)度。無關(guān)序列肽探針GGG*-FITC作為對(duì)照探針，正常胃黏膜上皮細(xì)胞系GES作為陰性對(duì)照細(xì)胞系；
　　(3)使用熒光探針SNF*-FITC和胃癌細(xì)胞懸液進(jìn)

5、行孵育，使用熒光激活細(xì)胞分選術(shù)檢測(cè)結(jié)合比例和熒光強(qiáng)度。GGG*-FITC作為對(duì)照探針，GES作為對(duì)照細(xì)胞系；
　　(4)使用生物素標(biāo)記的短肽SNFYMPL-biotin對(duì)胃癌細(xì)胞系進(jìn)行免疫化學(xué)染色，并進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)比較其與未標(biāo)記肽的結(jié)合能力。
　　2、驗(yàn)證熒光探針SNF*-FITC與胃癌組織的集合和能力。
　　(1)胃癌手術(shù)切除組織和鄰近非腫瘤組織的快速冰凍切片，使用兩種探針進(jìn)行熒光染色，使用共聚焦顯微鏡觀察熒光強(qiáng)度

6、，統(tǒng)計(jì)陽性率；
　　(2)胃癌手術(shù)切除組織塊和鄰近非腫瘤組織使用探針進(jìn)行熒光染色，使用探頭式活體共聚焦激光顯微內(nèi)鏡觀察分辨能力，統(tǒng)計(jì)陽性率；
　　(3)每例患者樣本均做HE染色，結(jié)果作為金標(biāo)準(zhǔn)。
　　3、驗(yàn)證在內(nèi)鏡檢查中使用熒光探針SNF*-FITC發(fā)現(xiàn)胃癌組織的能力：建立胃癌的裸鼠皮下荷瘤模型，使用IVIS觀察熒光探針在動(dòng)物活體上與腫瘤組織的結(jié)合能力。
　　結(jié)果:
　　(1)合成了短肽熒光探針SNF*-F

7、ITC，純度達(dá)到95.99％。
　　(2)腫瘤細(xì)胞系的熒光染色，可見SNF*-FITC探針優(yōu)先結(jié)合在腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，與正常胃粘膜上皮細(xì)胞幾乎不結(jié)合；熒光強(qiáng)度明顯強(qiáng)于對(duì)照肽探針GGG*-FITC。
　　(3)熒光激活細(xì)胞分選，兩種胃癌細(xì)胞系與SNF*-FITC的平均結(jié)合熒光強(qiáng)度均在102左右，結(jié)合比例高于95％，對(duì)照探針以及正常胃粘膜上皮細(xì)胞熒光強(qiáng)度和結(jié)合比例均低于100和1%。
　　(4)細(xì)胞的免疫化學(xué)染色，

8、SNFYMPL-biotin與腫瘤細(xì)胞結(jié)合呈強(qiáng)陽性，與GES結(jié)合呈弱陽性。用過量未標(biāo)記的短肽SNFYMPL與之競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，細(xì)胞仍可與標(biāo)記生物素的肽結(jié)合、呈色，表明連接成為探針的短肽和未標(biāo)記短肽都有相似的靶向腫瘤細(xì)胞能力。
　　(5)冰凍切片的熒光染色，SNF*-FITC對(duì)胃癌組織熒光染色的陽性率為81.25%(39/48)，明顯優(yōu)于無關(guān)序列肽探針的14.58%(7/48)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。SNF*-FITC對(duì)癌旁

9、組織熒光染色的陽性率為27.08%(13/48)，明顯低于對(duì)胃癌組織熒光染色陽性率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。
　　(6)組織塊的SNF*-FITC熒光探針染色，使用探頭式活體共聚焦激光顯微內(nèi)鏡檢測(cè)，胃癌組織的染色陽性率為83.33%(5/6)。
　　結(jié)論:
　　SNFYMPL制備的熒光探針SNF*-FITC與胃癌細(xì)胞系有較強(qiáng)結(jié)合能力和特異性，明顯優(yōu)于無關(guān)序列肽探針GGG*-FITC。其結(jié)合靶標(biāo)位于腫瘤細(xì)胞的