SNFYMPL 熒光探針結合共聚焦激光顯微內(nèi)鏡在胃癌診斷中的應用.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、背景:
  近年來,胃癌在世界范圍內(nèi)的發(fā)病率明顯降低,但仍然是患病率第五位和死亡率第三的腫瘤,東亞地區(qū)更是胃癌的高發(fā)地區(qū)。早診斷和早治療是提高胃癌病人生存率的關鍵手段。普通白光內(nèi)鏡診斷早期胃癌較為困難,對內(nèi)鏡醫(yī)生的經(jīng)驗要求較高。CLE是近年來興起的新型內(nèi)鏡檢查技術,在診斷胃腸道粘膜微小病變上具有明顯優(yōu)勢,CLE與分子探針結合(mCLE)實現(xiàn)特定靶分子的成像,可以在在體情況下檢測分子表型的異常。目前,相關研究使用的探針一般為熒光標記

2、的抗體和短肽,相比抗體,熒光標記的短肽探針,具有諸多優(yōu)點。線性七肽SNFYMPL是通過噬菌體展示技術和全細胞差減法,用Barrett食管組織篩選出的新型靶向肽。研究表明,該靶向肽可通過連接片段標記熒光分子成為熒光探針,短肽熒光探針可以特異性結合食管腺癌細胞系OE33。熒光探針孵育離體組織,表明探針與高級別上皮內(nèi)瘤變食管粘膜選擇性結合,親和性明顯高于鱗狀上皮和腸化生組織,具備在黏膜局部發(fā)現(xiàn)食管腺癌及其癌前病變的能力。
  由于胃癌和

3、食管腺癌有著相似的組織來源和疾病演變過程,SNFYMPL制作的熒光探針用于胃癌診斷成為可能。前期工作中,我們對該短肽與胃癌細胞的結合能力做了初步檢測,該短肽同樣可以與胃癌細胞系結合,但其在體內(nèi)外胃癌細胞上結合的特異性以及潛在的人體應用價值尚不明確。
  目的:
  1、合成熒光探針SNF*-FITC,并驗證其與胃癌細胞系的結合能力;
  2、驗證熒光探針SNF*-FITC與胃癌組織的結合能力。
  方法:

4、  1、合成熒光探針SNF*-FITC,并驗證與胃癌細胞系的結合能力。
  (1)在試劑公司協(xié)助下,從頭合成熒光探針,使用HPLC和 ESI-MS等技術純化鑒定成品質(zhì)量;
  (2)使用熒光探針SNF*-FITC對兩種胃癌細胞系進行熒光染色,使用共聚焦顯微鏡觀察熒光強度。無關序列肽探針GGG*-FITC作為對照探針,正常胃黏膜上皮細胞系GES作為陰性對照細胞系;
  (3)使用熒光探針SNF*-FITC和胃癌細胞懸液進

5、行孵育,使用熒光激活細胞分選術檢測結合比例和熒光強度。GGG*-FITC作為對照探針,GES作為對照細胞系;
  (4)使用生物素標記的短肽SNFYMPL-biotin對胃癌細胞系進行免疫化學染色,并進行競爭結合實驗比較其與未標記肽的結合能力。
  2、驗證熒光探針SNF*-FITC與胃癌組織的集合和能力。
  (1)胃癌手術切除組織和鄰近非腫瘤組織的快速冰凍切片,使用兩種探針進行熒光染色,使用共聚焦顯微鏡觀察熒光強度

6、,統(tǒng)計陽性率;
  (2)胃癌手術切除組織塊和鄰近非腫瘤組織使用探針進行熒光染色,使用探頭式活體共聚焦激光顯微內(nèi)鏡觀察分辨能力,統(tǒng)計陽性率;
  (3)每例患者樣本均做HE染色,結果作為金標準。
  3、驗證在內(nèi)鏡檢查中使用熒光探針SNF*-FITC發(fā)現(xiàn)胃癌組織的能力:建立胃癌的裸鼠皮下荷瘤模型,使用IVIS觀察熒光探針在動物活體上與腫瘤組織的結合能力。
  結果:
  (1)合成了短肽熒光探針SNF*-F

7、ITC,純度達到95.99%。
  (2)腫瘤細胞系的熒光染色,可見SNF*-FITC探針優(yōu)先結合在腫瘤細胞的細胞膜和細胞質(zhì),與正常胃粘膜上皮細胞幾乎不結合;熒光強度明顯強于對照肽探針GGG*-FITC。
  (3)熒光激活細胞分選,兩種胃癌細胞系與SNF*-FITC的平均結合熒光強度均在102左右,結合比例高于95%,對照探針以及正常胃粘膜上皮細胞熒光強度和結合比例均低于100和1%。
  (4)細胞的免疫化學染色,

8、SNFYMPL-biotin與腫瘤細胞結合呈強陽性,與GES結合呈弱陽性。用過量未標記的短肽SNFYMPL與之競爭結合,細胞仍可與標記生物素的肽結合、呈色,表明連接成為探針的短肽和未標記短肽都有相似的靶向腫瘤細胞能力。
  (5)冰凍切片的熒光染色,SNF*-FITC對胃癌組織熒光染色的陽性率為81.25%(39/48),明顯優(yōu)于無關序列肽探針的14.58%(7/48),差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。SNF*-FITC對癌旁

9、組織熒光染色的陽性率為27.08%(13/48),明顯低于對胃癌組織熒光染色陽性率,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。
  (6)組織塊的SNF*-FITC熒光探針染色,使用探頭式活體共聚焦激光顯微內(nèi)鏡檢測,胃癌組織的染色陽性率為83.33%(5/6)。
  結論:
  SNFYMPL制備的熒光探針SNF*-FITC與胃癌細胞系有較強結合能力和特異性,明顯優(yōu)于無關序列肽探針GGG*-FITC。其結合靶標位于腫瘤細胞的

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