NF-κB和c-Jun-AP-1在抗β2GPI-β2GPI復(fù)合物誘導(dǎo)單核細(xì)胞表達(dá)TF中的作用探討.pdf

1、研究目的:
　　 近期國(guó)內(nèi)外研究顯示，抗磷脂綜合征(antiphospholipidsyndrome，APS)血栓形成的病理機(jī)制與血清中高滴度的抗磷脂抗體密切相關(guān)，尤其是針對(duì)β2GPI的抗體，但是有關(guān)其血栓形成的機(jī)制仍未闡明。本課題組前期研究揭示，在anti-β2GPI/β2GPI復(fù)合物刺激人單核細(xì)胞株THP-1表達(dá)組織因子(tissuefactor，TF)的過(guò)程中，跨膜蛋白Toll樣受體4(Toll-likereceptor4

2、，TLR4)及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子能夠被誘導(dǎo)表達(dá)并參與細(xì)胞的激活作用，并且部分依賴(lài)膜聯(lián)蛋白Ⅱ(AnnexinA2，ANX2)，成為抗磷脂綜合征(antiphospholipidsyndrome，APS)血栓形成的機(jī)制之一。本論文重點(diǎn)探討TLR4引發(fā)的信號(hào)通路中關(guān)鍵分子——核因子κB(nuclearfactorkappaB，NF-κB)和激活蛋白-1(activatorprotein，AP-1)在此過(guò)程中的作用及可能的調(diào)節(jié)機(jī)制。
　　

3、研究方法:
　　 (1)利用實(shí)時(shí)定量PCR(Real-timequantitativePCR，RT-qPCR)檢測(cè)anti-β2GPI/β2GPI復(fù)合物誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞或人外周血單核細(xì)胞TFmRNA的表達(dá)，采用試劑盒檢測(cè)TF活性。
　　 (2)Westernblotting檢測(cè)anti-β2GPI/β2GPI復(fù)合物刺激THP-1細(xì)胞或人外周血單核細(xì)胞NF-κBp65和c-Jun/AP-1表達(dá)及其磷酸化情況，并檢測(cè)ant

4、i-β2GPI/β2GPI刺激的時(shí)效性和特異性。
　　 (3)采用PDTC（NF-κB抑制劑）和姜黃素（AP-1抑制劑）預(yù)處理THP-1細(xì)胞，觀察其對(duì)anti-β2GPI/β2GPI復(fù)合物誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞表達(dá)TF的干預(yù)作用。
　　 (4)采用MAPKs抑制劑SB203580(p38抑制劑)、U0126(ERK1/2抑制劑)、SP600125(JNK1/2抑制劑)預(yù)處理THP-1細(xì)胞，觀察其對(duì)anti-β2GPI/β2G

5、PI復(fù)合物誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞NF-κBp65和c-Jun/AP-1磷酸化的干預(yù)作用。
　　 (5)采用TLR4特異性抑制劑TAk-242預(yù)處理THP-1細(xì)胞，觀察其對(duì)anti-β2GPI/β2GPI復(fù)合物誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞NF-κBp65和c-Jun/AP-1磷酸化的干預(yù)作用。
　　 研究結(jié)果:
　　 (1)Anti-β2GPI/β2GPI復(fù)合物（100μg/mL）能顯著增加THP-1細(xì)胞及人外周血單核細(xì)胞TFm

6、RNA水平及TF活性，與對(duì)照組比較差異顯著(p＜0.05)。
　　 (2)Anti-β2GPI/β2GPI復(fù)合物（100μg/mL）能顯著增加THP-1細(xì)胞或人外周血單核細(xì)胞NF-κBp65和c-Jun/AP-1磷酸化水平，并顯示時(shí)間效應(yīng)，分別于刺激90min和60min時(shí)磷酸化最強(qiáng)。
　　 (3)PDTC(20μM)和姜黃素(25μM)分別單獨(dú)預(yù)處理THP-1細(xì)胞，均能明顯抑制anti-β2GPI/β2GPI對(duì)TF表達(dá)

7、的刺激效應(yīng)。而兩者聯(lián)合使用時(shí)沒(méi)有疊加效應(yīng)。
　　 (4)MAPKs抑制劑[SB203580(10μM)、U0126(5μM)、SP600125(90nM)]分別單獨(dú)或者兩兩聯(lián)合預(yù)處理THP-1細(xì)胞，單獨(dú)使用時(shí)均未能顯著抑制anti-β2GPI/β2GPI或LPS對(duì)NF-κBp65和c-Jun/AP-1的磷酸化;而任意兩種抑制劑組合[SB203580/U0126、SB203580/SP600125、U0126/SP600125]均

8、能顯著抑制anti-β2GPI/β2GPI或LPS對(duì)NF-κBp65的磷酸化，但只有SB203580/SP600125和U0126/SP600125兩組能顯著抑制c-Jun/AP-1的磷酸化。
　　 (5)TLR4抑制劑TAK-242(5μM)未能抑制anti-ββ2GPI/β2GPI對(duì)THP-1細(xì)胞NF-κBp65和c-Jun/AP-1磷酸化的刺激效應(yīng)，但是能明顯降低LPS對(duì)THP-1細(xì)胞NF-κBp65和c-Jun/AP-1

9、的磷酸化。
　　 結(jié)論:
　　 (1)Anti-β2GPI/β2GPI刺激單核細(xì)胞株THP-1或人外周血單核細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)的核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和AP-1被誘導(dǎo)發(fā)生磷酸化，最終促進(jìn)細(xì)胞表達(dá)TF，可能是APS血栓形成的重要分子機(jī)制之一。
　　 (2)在anti-β2GPI/β2GPI誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞或人外周血單核細(xì)胞表達(dá)TF所涉及的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，NF-κB和AP-1作為關(guān)鍵分子而發(fā)揮作用，TLR4及MAPKs為