MyD88和TRIF依賴途徑均參與TLR4介導(dǎo)anti-β2GPI-β2GPI復(fù)合物激活THP-1細(xì)胞.pdf

1、研究目的:
　　 抗磷脂綜合征(antiphos pholipid syndrome,APS)病理機(jī)制及臨床癥狀與血栓形成密切相關(guān),但有關(guān)其血栓形成的機(jī)制仍未闡明。研究表明,膜聯(lián)蛋白Ⅱ(AnnexinA2,ANX2)作為抗磷脂抗體/抗原復(fù)合物(anti-β2-glycoproteinⅠ/β2-glycoproteinI,anti-β2GPI/β2GPI)的受體,在介導(dǎo)自身抗體激活細(xì)胞過程中發(fā)揮重要作用。然而,ANX2缺乏膜內(nèi)結(jié)構(gòu)

2、,不能傳遞胞外信號(hào)至胞內(nèi)。本課題組前期研究揭示,在anti-β2GPI/β2GPI復(fù)合物刺激人單核細(xì)胞株THP-1表達(dá)組織因子(tissue factor,TF)的過程中,跨膜蛋白Toll樣受體4(Toll-like receptor4,TLR4)能夠被誘導(dǎo)表達(dá)并參與細(xì)胞的激活作用。本論文將深入闡明TLR4、ANX2及β2GPI三者之間的關(guān)系,進(jìn)一步探討TLR4的二個(gè)不同接頭分子,MyD88(myeloid differentiatio

3、nfactor88)及TRIF(TIR-domain-containingadaptorinducinginterferon-β)是否同樣參與了anti-β2GPI/β2GPI對(duì)THP-1細(xì)胞的激活,旨在全面闡明TLR4及其信號(hào)通路在APS病理機(jī)制中的作用。
　　 研究方法:
　　 (1)免疫共沉淀及Westernblotting檢測(cè)anti-β2GPI/β2GPI復(fù)合物與THP-1細(xì)胞表面受體TLR4、ANX2的結(jié)合情

4、況,證明細(xì)胞表面是否有β2GPI、ANX2和TLR4三者的復(fù)合物。
　　 (2)利用實(shí)時(shí)定量PCR(Real-timequantitativePCR,RT-qPCR)檢測(cè)anti-β2GPI/β2GPI誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞TF和TNF-αmRNA的表達(dá),采用試劑盒檢測(cè)細(xì)胞TF活性和TNF-α分泌水平。
　　 (3)RT-qPCR、Westernblotting檢測(cè)anti-β2GPI/β2GPI對(duì)MyD88和TFIF表達(dá)的

5、影響。
　　 (4)觀察TLR4特異性抑制劑-Tak-242是否干預(yù)anti-β2GPI/β2GPI
　　 誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞MyD88、TRIF、TF及TNF-α的表達(dá)。
　　 研究結(jié)果:
　　 (1)免疫共沉淀及Westernblotting分析,發(fā)現(xiàn)THP-1細(xì)胞表面存在β2GPI、ANX2和TLR4三者的復(fù)合物。
　　 (2)Anti-β2GPI/132GPI(100μg/mL)能夠刺激T

6、HP-1細(xì)胞表達(dá)TF(mRNA及活性)和TNF-α(mRNA及蛋白),與對(duì)照相比差異顯著(p＜0.05)。
　　 (3)Anti-β2GPI/β2GPI(100μg/mL)刺激THP-1細(xì)胞后,MyD88和TRIF的mRNA及蛋白水平均增高,并顯示時(shí)間相關(guān)性。
　　 (4)TLR4抑制劑TAK-242(5μmol/L)明顯抑制anti-β2GPI/β2GPI對(duì)THP-1細(xì)胞MyD88和TRIFmRNA及蛋白表達(dá)的刺激效應(yīng)

7、,同時(shí)降低細(xì)胞TF和TNF-α的表達(dá)。
　　 結(jié)論:
　　 (1)在THP-1細(xì)胞,TLR4與ANX2作為βGPI的共受體,能夠介導(dǎo)anti-β2GPI/β2GPI復(fù)合物刺激細(xì)胞表達(dá)TF、TNF-α,從而參與APS高凝及血栓形成。
　　 (2)在anti-β2GPI/β2GPI激活THP-1細(xì)胞的過程中,TLR4的二個(gè)不同接頭分子,即MyD88和TFIF均被誘導(dǎo)表達(dá)增加,提示MyD88及TFIF依賴的信號(hào)途徑均參