竹節(jié)參的分子鑒定及其β-香樹脂醇合成酶基因克隆、生物信息學(xué)分析.pdf

1、目的：
　　竹節(jié)參為五加科人參屬植物，其主要活性成分為三萜皂苷化合物。分布地域廣泛，變異性較大。為了深入研究竹節(jié)參的生物活性及其藥材的真?zhèn)?，本?xiàng)目利用GenBank核酸數(shù)據(jù)庫中ITS2序列對(duì)竹節(jié)參進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化鑒定，并克隆三萜皂苷代謝關(guān)鍵酶竹節(jié)參β-香樹脂醇合成酶（beta-amyrin synthase,β-AS）基因cDNA序列全長(zhǎng)，同時(shí)采用生物信息學(xué)分析β-AS蛋白序列及其結(jié)構(gòu)與功能，為竹節(jié)參皂苷合成及調(diào)控機(jī)制研究提供基礎(chǔ)。<

2、br>　　方法：
　?。?）提取竹節(jié)參樣本基因組DNA，使用ITS2通用引物擴(kuò)增ITS2序列并測(cè)序，測(cè)序結(jié)果使用CodonCode Aligner V5.1進(jìn)行校對(duì)拼接，與GenBank核酸數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對(duì)，應(yīng)用MEGA5.0軟件基于K2P模型計(jì)算遺傳距離和構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。
　　（2）以竹節(jié)參葉片為材料提取RNA，RT-PCR方法擴(kuò)增β-AS基因編碼區(qū)序列，將序列連接至pMDTM18-T載體進(jìn)行克隆、測(cè)序。利用生物信

3、息學(xué)分析比較移栽品和栽培品竹節(jié)參β-AS蛋白的特征，并使用MEGA5.0構(gòu)建竹節(jié)參β-AS蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹。
　　結(jié)果：
　　（1）擴(kuò)增得到竹節(jié)參樣本的ITS2片段長(zhǎng)度均為230bp,并且序列一致率為100％。序列同源性分析發(fā)現(xiàn)，竹節(jié)參樣本ITS2序列與竹節(jié)參（KT380920.1）親緣關(guān)系最近，它們之間的K2P遺傳距離為0，在NJ樹上也是聚為同一枝上，支持率為75%。
　?。?）克隆出移栽品和栽培品竹節(jié)參的β-AS基

4、因編碼區(qū)序列，ORF均為2286bp,編碼761個(gè)氨基酸。
　?。?）生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)2個(gè)品種β-AS蛋白兩者在細(xì)胞中的基本結(jié)構(gòu)和功能是一致的，均為親水性蛋白，不存在信號(hào)肽，不具有跨膜結(jié)構(gòu)，蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)最主要結(jié)構(gòu)元件是α-螺旋和無規(guī)則卷曲，可能定位于葉綠體，屬于氧化鯊烯環(huán)化酶（OSC）家族，具有MWCRCY、QW(QXXXXXW)和DCTAE3個(gè)OSC基因家族特征保守模體。但兩者之間存在8個(gè)氨基酸差異，使兩者的理化性質(zhì)、蛋白質(zhì)二

5、級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)以及磷酸化位點(diǎn)稍有差異，可能會(huì)導(dǎo)致兩者的催化活性存在差異。β-AS蛋白同源性分析結(jié)果顯示，2個(gè)品種竹節(jié)參β-AS蛋白與五加科人參屬植物親緣關(guān)系最近，其中與西洋參（AGG09939.1）的同源性最高。
　　結(jié)論：
　　本研究中采用ITS2序列條形碼對(duì)采集的竹節(jié)參樣本進(jìn)行物種鑒定，從分子水平上進(jìn)一步佐證植物樣本物種為五加科人參屬竹節(jié)參?？寺〉玫揭吧圃云泛驮耘嗥分窆?jié)參的β-AS基因全長(zhǎng)，并對(duì)2個(gè)品種β-AS蛋白進(jìn)行了