基于RNA-Seq技術(shù)發(fā)現(xiàn)福氏志賀菌新sRNA及探討其致病機制研究.pdf

1、目前研究表明，sRNA（small regulatory RNAs）在細菌生命的各個環(huán)節(jié)均發(fā)揮著重要調(diào)控作用，細菌10％－30%的基因受sRNA調(diào)控，如sRNA參與了細菌環(huán)境耐受、質(zhì)粒復制和細菌入侵等重要功能調(diào)節(jié)。為此，本文以志賀菌為研究對象，運用RNA-seq技術(shù)開展了新sRNA發(fā)現(xiàn)研究，并探討其可能的致病機制。
　　志賀菌每年導致全球約1.6億人感染，絕大多數(shù)在發(fā)展國家，并導致110萬死亡，我國的志賀菌感染也非常嚴重，在我國乙

2、類傳染病發(fā)病率中志賀菌位于第4位，病死率位居第3位，且在我國以福氏志賀菌流行為主。然而，與大腸桿菌中已發(fā)現(xiàn)100余條sRNA相比，福氏志賀菌僅有2條sRNA被功能注釋，因此，系統(tǒng)開展福氏志賀菌的sRNA識別和功能研究，闡明sRNA在福氏志賀菌致病過程中的重要生物學功能和具體的作用機制，將為進一步抗志賀菌感染提供更為深入的理論基礎(chǔ)和可能的藥物新靶標，對闡明細菌的致病機制和抗細菌感染研究具有重要意義。
　　RNA-seq技術(shù)不僅可以檢

3、測基因序列，還可以檢測它們的表達水平，同時可以識別大量未知轉(zhuǎn)錄本，且具有檢測準確率高、重復性好和高通量等特點，被廣泛用于細菌sRNA發(fā)現(xiàn)。另外，目前研究發(fā)現(xiàn)，細菌sRNA分子伴侶蛋白HFQ通過與 sRNA結(jié)合調(diào)控細菌的環(huán)境耐受力和毒力等功能。因此，本研究基于RNA-Seq技術(shù)，在福氏志賀菌首次開展hfq基因缺失株和野生株轉(zhuǎn)錄譜研究，發(fā)現(xiàn)hfq基因在福氏志賀菌中的功能和調(diào)控機制。并結(jié)合生物信息學預測與實驗驗證，在福氏志賀菌中系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)了與H

4、FQ蛋白結(jié)合的新sRNA基因，同時，結(jié)合sRNA靶標預測，開展新發(fā)現(xiàn)sRNA可能致病機制研究，本文主要包括如下5個部分：
　　第一部分：利用λ-RED同源重組方法成功構(gòu)建了福氏志賀菌hfq基因突變株，并對福氏志賀菌開展hfq基因缺失株和野生株轉(zhuǎn)錄譜測序，獲得了福氏志賀菌野生株301與hfq基因缺失株高質(zhì)量的轉(zhuǎn)錄譜序列，為闡明hfq基因在福氏志賀菌中的功能，以及福氏志賀新sRNA的發(fā)現(xiàn)及其可能調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建提供了數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。
　

5、　第二部分：系統(tǒng)分析了野生株301和hfq基因缺失株的高通量測序數(shù)據(jù)，初步發(fā)現(xiàn)了hfq基因的調(diào)控功能，分析結(jié)果顯示，HFQ調(diào)控了福氏志賀菌基因組約16.05%的基因，且大多數(shù)與毒力相關(guān)的基因在hfq基因缺失株中顯著低表達，定量PCR結(jié)果與測序結(jié)果一致，說明HFQ直接或間接的調(diào)控這些毒力因子。同時， T3SS是志賀菌侵入宿主細胞所必不可少的，然而在hfq基因缺失株中，T3SS相關(guān)的基因及其調(diào)控基因均顯著下調(diào)或者不表達，表明 HFQ蛋白參與

6、了 T3SS系統(tǒng)的調(diào)控。而部分耐酸基因在缺失株也出現(xiàn)了顯著下調(diào)，說明HFQ蛋白也參與了耐酸調(diào)節(jié)。
　　第三部分：通過對轉(zhuǎn)錄譜數(shù)據(jù)的深入分析，發(fā)現(xiàn)了大量位于基因間區(qū)的新轉(zhuǎn)錄本，共獲得了717條新sRNA，而野生株301和hfq基因缺失株之間具有顯著差異的sRNA有280條，這些sRNA可能與HFQ結(jié)合來發(fā)揮調(diào)控作用。為了提高發(fā)現(xiàn)新sRNA的準確性，我們還對新發(fā)現(xiàn)sRNA開展啟動子和終止子預測，發(fā)現(xiàn)共有243條sRNA具有完整轉(zhuǎn)錄單元

7、，我們?nèi)￠L度大于80bp的92條sRNA用作下一步的實驗驗證。
　　第四部分：利用反轉(zhuǎn)錄PCR方法，對92條sRNA在不同的生長階段（6小時、9小時和12小時）分別進行檢測，結(jié)果表明，92條sRNA在不同的時間點全部被檢測到。同時，我們也對這92條sRNA開展Nothern雜交檢測，最終發(fā)現(xiàn)10 sRNA有雜交信號，新發(fā)現(xiàn)的10條sRNA分別命名為：sf29、sf46、sf47、sf63、sf69、sf80、sf83、sf86、s

8、f87、sf90。
　　第五部分：我們對新發(fā)現(xiàn)的10條sRNA開展系統(tǒng)的靶標預測，發(fā)現(xiàn)其可能的作用機制和通路，發(fā)現(xiàn)sRNA sf46、sf69、sf80可能參與了毒力調(diào)控，其主要的靶標是T3SS基因；sRNA sf83參與了適應環(huán)境壓力調(diào)控，其調(diào)控通路主要是通過sf83 sRNA與HFQ結(jié)合來調(diào)節(jié)evgS表達，而evgS表達水平的改變導致耐受環(huán)境蛋白evgA的變化，進而影響志賀菌的耐受性；sRNA sf63、sf83、sf87、s

9、f90同時參與了毒力和環(huán)境耐受調(diào)控，主要是通過調(diào)控 T3SS來發(fā)揮致病調(diào)節(jié)，而通過調(diào)節(jié)hdeB和hdeB等耐酸蛋白來進行環(huán)境耐受調(diào)控。
　　第一部分構(gòu)建的福氏志賀菌hfq基因突變株，為第二部分獲得野生株和hfq基因缺失株的高通量測序數(shù)據(jù)奠定基礎(chǔ)，而高通量數(shù)據(jù)的獲得為第三部分研究hfq基因功能及發(fā)現(xiàn)新sRNA提供數(shù)據(jù)支持，第四部分則為預測的sRNA候選基因開展系統(tǒng)實驗驗證，第五部分則是對新發(fā)現(xiàn)的sRNA開展靶標預測，發(fā)現(xiàn)其可能的作用