基于肽段N端或組氨酸結(jié)合反應的蛋白質(zhì)混合物簡化策略.pdf

1、復雜生物體系中的蛋白質(zhì)以及因不同修飾而產(chǎn)生的蛋白質(zhì)異構(gòu)體的數(shù)量可達百萬種。隨著蛋白質(zhì)組學研究的深入進展，這些動態(tài)范圍過寬、理化性能差異過大的復雜蛋白質(zhì)為探索生命活動的本質(zhì)帶來了巨大挑戰(zhàn)。高豐度蛋白質(zhì)因其表達水平高而容易被有效分離鑒定，與此相比中低豐度蛋白質(zhì)由于本身數(shù)量龐大，組成復雜而不易被有效檢測，在分離和鑒定過程中，高豐度蛋白質(zhì)的強信號也會掩蓋或結(jié)合大量的低豐度蛋白質(zhì)，為中低豐度蛋白質(zhì)的分離鑒定造成極大干擾。不僅是低豐度蛋白質(zhì)，對于很

2、多高豐度蛋白質(zhì)的研究，同樣面臨質(zhì)譜分析結(jié)果的序列覆蓋率低，定量穩(wěn)定性差等問題，這給蛋白質(zhì)組研究中的分析鑒定方法學帶來了巨大的挑戰(zhàn)。針對此問題，科研人員從不同的角度入手提出解決方案。
　　在蛋白質(zhì)組的研究中，鳥槍法被廣泛地應用于蛋白質(zhì)檢測。蛋白質(zhì)混合物被酶解為肽段的混合物，然后利用質(zhì)譜進行測序分析，計算機根據(jù)科研人員已經(jīng)設定的計算法則，將實驗譜圖與理論譜圖匹配，并找到鑒定肽段在蛋白質(zhì)序列中的相應位置，從而確定該混合物中具體的蛋白質(zhì)成

3、分。鳥槍法的應用擺脫了傳統(tǒng)凝膠分離技術(shù)中的限制與不足，同時也帶來了相應的弊端。
　　通過鳥槍法，混合溶液中不僅產(chǎn)生了易于質(zhì)譜檢測的高豐度肽段，也產(chǎn)生了難以檢測到的低豐度肽段。所謂低豐度，并不意味著這些肽段含量非常低，它們可能僅僅是被數(shù)量巨大的高豐度肽段抑制，或者在質(zhì)譜分析時，離子化效率偏低，由于質(zhì)譜靈敏度的限制，在圖譜采集時更容易被遺漏掉。但是，即便是因為各種原因，部分肽段的序列及其翻譯后修飾變體，無法有效監(jiān)測，并不意味著這些序列

4、攜帶的信息不重要。相反，我們要發(fā)展相應的技術(shù)體系與方法，幫助發(fā)現(xiàn)這些遺漏的肽段或蛋白質(zhì)。
　　大量的研究結(jié)果表明，低豐度肽段、蛋白質(zhì)，在生物界中往往攜帶著重要的信息或是發(fā)揮著不可取代的作用。經(jīng)過多年來的研究表明，在疾病治療方面，低豐度肽段或是蛋白質(zhì)往往充當了診斷、預后和治療效果的標記物，同時它們也可能是治療的靶點。因此，對于高豐度蛋白質(zhì)去除和低豐度蛋白質(zhì)的富集、鑒定成為了具有重要意義的研究方向。
　　要改善低豐度蛋白質(zhì)的鑒定

5、，一般通過三種機制：(1)消耗高豐度蛋白質(zhì)；(2)富集低豐度蛋白質(zhì)；(3)提高質(zhì)譜對蛋白質(zhì)的靈敏度與準確度。其中提高色譜、質(zhì)譜的分離與分辨率成本高，且容易受到儀器本身的條件限制，因此，目前國際上對于中低豐度的分離與鑒定主要在富集低豐度蛋白質(zhì)方面，例如抗體免疫去除；蛋白均衡器；修飾蛋白質(zhì)、核酸結(jié)合蛋白質(zhì)富集等，但是這些方法具有選擇性，對于復雜樣本的通用性較差?，F(xiàn)在的問題是，我們?nèi)狈νㄓ眯院玫牡鞍踪|(zhì)復雜體系簡化策略，因此該研究課題從兩個方面

6、展開：第一，利用氨基活性反應基團或羧基活性反應基團與化學基團的無差別反應，達到復雜系統(tǒng)中高豐度蛋白質(zhì)或肽段的消減；第二，靶向富集含某種特定氨基酸的肽段，從而簡化體系，降低基質(zhì)效應。
　　本論文共分為三個部分，第一章概述了蛋白質(zhì)組研究中低豐度蛋白質(zhì)的富集、鑒定技術(shù)，以及靶向富集含特定氨基酸肽段的意義、現(xiàn)狀與研究進展，同時對目前國際上低豐度研究的常用方法，例如抗體免疫去除、蛋白均衡器、修飾蛋白質(zhì)、核酸結(jié)合等進行了分析研究，在此基礎(chǔ)上提

7、出了本論文的研究內(nèi)容與目標，即通用性強的高豐度蛋白質(zhì)去除方法以及特異性肽段富集策略。
　　在第二章，我們開展了通用性強的高豐度蛋白質(zhì)去除方法的探究。在這一部分中，我們利用酶切后肽段末端氨基活性反應基團或羧基活性反應基團與活性試劑發(fā)生結(jié)合作用從而去除高豐度肽段，并進一步優(yōu)化結(jié)合氨基或羧基的濃度速率關(guān)系實現(xiàn)研究目的。
　　首先是對該實驗的基礎(chǔ)部分進行研究，我們考察了模型生物酵母細胞三種常用的不同方法，對比了它們的提取效率，提取方

8、法的重復性考察，不同提取方法得到酵母蛋白質(zhì)的豐度與其相對譜圖數(shù)的線性關(guān)系的考察，可鑒定到的蛋白質(zhì)豐富范圍與理論值的比較。經(jīng)過該部分實驗，我們發(fā)現(xiàn)雖然NETN超聲破碎法的提取效率最高，但經(jīng)過FASP酶切處理，質(zhì)譜分析的結(jié)果顯示SDS堿裂解法與Urea超聲破碎法鑒定到了蛋白質(zhì)數(shù)量更多，其中SDS堿裂解法對肽段的修飾作用明顯，因此Urea超聲破碎法是理想的提取方法。
　　在第二部分的研究中，我采用Urea超聲破碎法進行酵母蛋白質(zhì)提取。通

9、過調(diào)研對比其他活性試劑，我選用了通用性強的CNBr活化瓊脂糖珠作為肽段氨基端反應試劑，質(zhì)譜分析結(jié)果顯示經(jīng)過多次結(jié)合后，部分肽段有損失，但是高豐度與低豐度之間拉平作用明顯。
　　在第三章中，由于隨著高通量蛋白質(zhì)組研究技術(shù)的發(fā)展，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜被廣泛的運用于深度地鑒定并定量分析目標肽段和蛋白質(zhì)。但由于峰容量限制、基質(zhì)效應等問題，在液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）分析中，只能獲得有效的蛋白質(zhì)序列覆蓋度，大量隱含肽段、色譜分離時的共洗脫肽

10、段，嚴重影響以二級質(zhì)譜為核心的定量方法的準確度。為了簡化分析體系，提高質(zhì)譜定量分析的準確度，本研究對含組氨酸肽段開展選擇性富集方法的探索，建立組氨酸肽段與定量蛋白質(zhì)組研究串聯(lián)的分析方法。實驗結(jié)果表明，Cu-beads與肽段反應30mins,肽段上樣量與Cu-beads比例為1：1（μg:ul）的情況下為最優(yōu)條件，可以實現(xiàn)穩(wěn)定性好，重現(xiàn)性高的his肽段選擇性富集。在iTRAQ按比例標記試驗中，含組氨酸肽段富集可以明顯改善定量分析的準確度。