炭疽芽胞桿菌A16R蛋白質(zhì)基因組學(xué)及芽胞萌發(fā)機(jī)制初步探索的研究.pdf

1、炭疽芽胞桿菌屬于革蘭氏陽(yáng)性菌，有莢膜，可以形成芽胞，芽胞對(duì)極端環(huán)境具有很強(qiáng)的抗逆性。自然界中的炭疽芽胞桿菌幾乎全部是以芽胞的形式存在，炭疽病的傳播和感染也主要是以芽胞的形式進(jìn)行。通過炭疽桿菌侵入人體的途徑不同，主要可以導(dǎo)致三種人類的炭疽?。浩つw炭疽、腸炭疽和肺炭疽，其中，肺炭疽所引起的病癥最為嚴(yán)重。炭疽的高致病性及其芽胞易于制備和存儲(chǔ)的特點(diǎn)使其成為生物武器的首選。因此，對(duì)于炭疽芽胞桿菌的研究不僅有助于炭疽病的防治，也是備戰(zhàn)可能存在的生物

2、恐怖的需要。
　　后基因組時(shí)代，蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)展迅速，主要的研究技術(shù)也從傳統(tǒng)的雙向電泳技術(shù)開始向質(zhì)譜研究過渡。質(zhì)譜的高通量、高精度等特點(diǎn)使蛋白質(zhì)組學(xué)的大規(guī)模研究成為可能。但是由于細(xì)菌蛋白組情況要比基因組情況復(fù)雜許多，尤其作為存在兩種生命狀態(tài)（繁殖體和芽胞）的炭疽芽胞桿菌，其不同的生命周期下，細(xì)菌蛋白質(zhì)組情況存在較大差異。質(zhì)譜技術(shù)雖然在不斷發(fā)展中逐漸完善，但對(duì)于蛋白質(zhì)組鑒定的覆蓋度一直是亟待解決的問題。與此同時(shí)，得益于質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，

3、蛋白質(zhì)基因組學(xué)作為一門新興學(xué)科逐漸發(fā)展起來，并以其先天的優(yōu)勢(shì)在基因注釋過程中發(fā)揮著越來越大的作用。
　　萌發(fā)過程是芽胞重新成長(zhǎng)為繁殖體的首要步驟。目前對(duì)于炭疽芽胞萌發(fā)的研究已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展，但其研究重點(diǎn)大多是集中在可觸發(fā)萌發(fā)的營(yíng)養(yǎng)/非營(yíng)養(yǎng)萌發(fā)劑、營(yíng)養(yǎng)萌發(fā)劑受體、芽胞皮層水解酶等方面，而且大多數(shù)情況是通過借鑒枯草芽胞桿菌中的研究情況來進(jìn)行的，對(duì)于萌發(fā)過程中的信號(hào)傳導(dǎo)情況的研究相對(duì)較少。
　　本研究首先采用了一維電泳與高分辨

4、率的LC-MS/MS質(zhì)譜結(jié)合的辦法，分別對(duì)炭疽芽胞桿菌的繁殖體對(duì)數(shù)前期以及休眠期芽胞的全菌蛋白進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定。在檢測(cè)過程中，采取了不同的實(shí)驗(yàn)條件：對(duì)于繁殖體對(duì)數(shù)前期的全菌蛋白檢測(cè)，分別采用了普通的SDS-PAGE和Tricine SDS-PAGE兩種電泳方式，其中Tricine SDS-PAGE在分離分子量較低的蛋白（1-100kDa）方面具有較大優(yōu)勢(shì)。兩種電泳方式下最終鑒定的蛋白數(shù)量分別為2702和3520，共同鑒定到的蛋白數(shù)量

5、為2510，總的蛋白鑒定數(shù)量為3712，對(duì)當(dāng)前的炭疽芽胞桿菌蛋白注釋庫(kù)的覆蓋度達(dá)到65％。對(duì)于芽胞的全菌蛋白樣品，共采用了6組不同的實(shí)驗(yàn)條件來查看檢測(cè)情況，首先采用了 Trypsin和 LysC兩種蛋白酶進(jìn)行酶切消化，而后的色譜分析采用了65min和100min兩種分析時(shí)間，在質(zhì)譜檢測(cè)過程中，二級(jí)質(zhì)譜的碎裂方式上也采用了CID碎裂和HCD碎裂兩種方式，最終的鑒定結(jié)果顯示，（1） Trypsin-65min-CID條件下鑒定數(shù)量為3165

6、，（2）Trypsin-65min-HCD條件下鑒定數(shù)量為2880，（3） Trypsin-100min-CID條件下鑒定數(shù)量為3287，（4） LysC-65min-CID條件下鑒定數(shù)量為2898，（5）LysC-65min-HCD條件下鑒定數(shù)量為2797，（6）LysC-100min-CID條件下鑒定數(shù)量為2935。由此初步建立起了繁殖體和休眠期芽胞的全菌蛋白質(zhì)組情況的蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)。
　　數(shù)據(jù)分析階段，首先建立了六讀碼框數(shù)據(jù)庫(kù)。

7、通過相關(guān)蛋白質(zhì)基因組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)了 A16R基因組數(shù)據(jù)存在的測(cè)序錯(cuò)誤以及這些測(cè)序錯(cuò)誤所導(dǎo)致的基因移碼、提前終止等情況并對(duì)部分錯(cuò)誤進(jìn)行了修正。與此同時(shí)，通過對(duì)六讀碼框數(shù)據(jù)庫(kù)的相關(guān)搜庫(kù)和分析比較，共發(fā)現(xiàn)了19個(gè)不屬于任何炭疽芽胞桿菌注釋的肽段碎片，其中13個(gè)肽段碎片屬于從未被注釋過的“新基因”的情況，6個(gè)肽段碎片顯示了現(xiàn)有的基因在翻譯起始位點(diǎn)存在注釋錯(cuò)誤。對(duì)上述肽段碎片進(jìn)行化學(xué)合成并質(zhì)譜檢測(cè)，比較發(fā)現(xiàn)，其中13個(gè)肽段碎片在前后兩次實(shí)驗(yàn)獲得的譜

8、圖相似度極高（包括9個(gè)“新基因”情況，4個(gè)翻譯起始位點(diǎn)注釋錯(cuò)誤的情況）。以綠色熒光作為報(bào)告信號(hào)的啟動(dòng)子檢測(cè)實(shí)驗(yàn)顯示，其中6個(gè)肽段碎片（2個(gè)“新基因”情況，4個(gè)翻譯起始位點(diǎn)注釋錯(cuò)誤情況）對(duì)應(yīng)的情況還觀察到了綠色熒光。通過該部分工作，修正了基因組存在的測(cè)序錯(cuò)誤，發(fā)現(xiàn)了已注釋基因的翻譯起始位點(diǎn)注釋錯(cuò)誤，并且發(fā)現(xiàn)了一部分從未被注釋的新基因。
　　通過雙向電泳技術(shù)，初步研究了萌發(fā)前后芽胞蛋白差異情況。芽胞的萌發(fā)過程一直被認(rèn)為是一個(gè)生物物理過

9、程，期間并不涉及太多的DNA、蛋白質(zhì)的合成等活動(dòng)。在本實(shí)驗(yàn)中，首先對(duì)高濃度 L-丙氨酸單獨(dú)誘導(dǎo)的芽胞萌發(fā)時(shí)間進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示，在芽胞接觸的到營(yíng)養(yǎng)萌發(fā)劑以后的幾分鐘（5-6min）內(nèi)，萌發(fā)速度最快，而后萌發(fā)速度逐漸趨于平緩，90min以后，基本萌發(fā)完全。萌發(fā)前后的蛋白樣品的雙向電泳結(jié)果顯示了9個(gè)蛋白差異點(diǎn)，其中6個(gè)蛋白差異點(diǎn)獲得了質(zhì)譜鑒定，除了芽胞外殼蛋白在萌發(fā)前后的蛋白量有所變化以外，參與糖酵解和糖原異生的烯醇化酶（enolase）

10、的蛋白量有所增加，該酶可以催化 D-2-磷酸甘油酸（D-(+)-2-phosphoglyceric acid）的脫水反應(yīng)，使其轉(zhuǎn)變?yōu)榱姿嵯┐际奖幔╬hosphoenolpyruvate），同時(shí)在氨基酸合成過程中也起到重要作用。其他發(fā)生變化的蛋白包括轉(zhuǎn)錄因子 DksA、轉(zhuǎn)運(yùn)增強(qiáng)蛋白 TepA等。分析結(jié)果顯示，這些蛋白的功能基本是具有“抑制”或“開啟”生命活動(dòng)功能的蛋白，很可能是芽胞結(jié)束休眠期并開始新的代謝過程的變化導(dǎo)致了其蛋白量的變化

11、。
　　綜上所述，本研究首先通過高精度蛋白質(zhì)組學(xué)，研究了炭疽芽胞桿菌繁殖體對(duì)數(shù)前期以及休眠期芽胞的全菌蛋白組情況，初步建立了這兩種狀態(tài)下的炭疽芽胞桿菌蛋白組情況數(shù)據(jù)庫(kù)。與此同時(shí)，通過新興的蛋白質(zhì)基因組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)了現(xiàn)有基因組存在的測(cè)序錯(cuò)誤及其所導(dǎo)致的注釋問題，發(fā)現(xiàn)了一部分已有注釋的翻譯起始位點(diǎn)的注釋錯(cuò)誤和新基因并進(jìn)行了驗(yàn)證。為補(bǔ)充和改善基因注釋以及新基因的查找提供了方法上的參考。此外，以休眠期芽胞蛋白組鑒定情況為依托，利用雙向電泳