炭疽芽胞桿菌BslA蛋白粘附功能研究.pdf

1、炭疽病是由炭疽芽胞桿菌(Bacillusanthracis)引起的一種人畜共患烈性傳染病，主要通過皮膚、呼吸道和消化道感染動物和人，嚴重危害人類和家畜的生命健康。大量研究表明，單一的PA組分疫苗并不能夠提供完全的免疫保護，以PA為主，輔以其它來自菌體或芽胞的保護性組份是一個比較理想的炭疽疫苗研究策略，因此研究者一直致力于尋找和鑒定新的炭疽芽胞桿菌保護性抗原。
　　 炭疽芽孢桿菌的細胞外膜由一層二維晶狀結(jié)構(gòu)S層蛋白包裹，其生物學(xué)功

2、能主要是作為保護性的外膜、分子泵和細菌粘附等。BslA蛋白(B.anthracisS-layerproteinA)由炭疽芽胞桿菌pXO1致病島區(qū)域上的bslA(pXO1-90)基因編碼，包含652個氨基酸殘基。BslA蛋白N端1-259位氨基酸殘基中含有三個保守的SLH基序(S-layer-homologousmotifs)，是一種典型的S層蛋白。BslA蛋白炭疽芽胞桿菌感染宿主后有穩(wěn)定的表達，天然表達的BslA與其它S層蛋白共同展示于

3、菌體表面。研究表明BslA蛋白在炭疽芽胞桿菌致病過程中起著重要作用。本研究擬對BslA蛋白功能及其核心結(jié)構(gòu)域方面進行研究，具體如下：
　　 第一部分工作利用PCR的技術(shù)擴增bslA基因片段，進行原核表達載體構(gòu)建、重組蛋白分離純化、多克隆抗體制備，并且通過流式細胞、細菌粘附抑制實驗、免疫熒光等實驗方法鑒定BslA蛋白的功能。從實驗結(jié)果來看，成功構(gòu)建重組菌株pET28a-BslA/Rosetta((DE3)并對BslA實現(xiàn)了可溶性表

4、達。通過ProBondTMPurificationsystem得到純度在87％以上的BslA蛋白，流式細胞與免疫熒光的結(jié)果表明BslA蛋白具有黏附功能。細菌粘附抑制實驗計算出BslA重組蛋白及其抗血清能夠抑制約為98％的炭疽桿菌黏附，表明BslA蛋白可能是一種潛在的保護性抗原。
　　 第二部分工作中，本實驗通過蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測軟件，確定核心功能結(jié)構(gòu)域可能存在的位置，從而進行分段研究。為了更好、更方便的撿測，我們將蛋白片段與EGFP蛋

5、白融合表達，使EGFP成為標簽。再通過免疫熒光等方法檢測BslA蛋白片段功能。結(jié)果表明，成功構(gòu)建了pET28a-EGFP/Rosetta(DE3)和實現(xiàn)了可溶性表達，并對其進行了純化。表達分析和流式細胞檢測結(jié)果表明，構(gòu)建的EGFP蛋白有很好的熒光性。另外，根據(jù)蛋白結(jié)構(gòu)軟件的預(yù)測我們對BslA蛋白進行了首次分段，成功構(gòu)建了pET28a-EGFP-BslA(260-500)/Rosetta(DE3)、pET28a-EGFP-BslA(411

6、-560)/Rosetta(DE3)、pET28a-EGFP-BslA(511-652)/Rosetta(DE3)，進行了截短BslA的表達與純化。經(jīng)熒光電鏡檢測結(jié)果表明，BslA(260-500)、BslA(411-560)具有黏附功能，以此推斷核心功能結(jié)構(gòu)域位于BslA蛋白的411-500位氨基酸。根據(jù)此結(jié)果，進行了第二次分段，成功構(gòu)建pET28a-EGFP-BslA(411-455)/Rosetta(DE3)、pET28a-EGF

7、P-BslA(431-485)/Rosetta(DE3)、pET28a-EGFP-BslA(456-500)/Rosetta(DE3)重組菌，對表達的蛋白進行了純化。免疫熒光檢測的結(jié)果表明BslA(411-455)、BslA(431-485)片段具有粘附功能，進一步確定了BslA蛋白的核心功能結(jié)構(gòu)域位于431-455位點。
　　 綜上，BslA是一種重要的保護性抗原，可能在新一代炭疽疫苗的研究和開發(fā)中扮演重要的角色。BslA蛋白