芽胞桿菌芽胞外壁蛋白exp基因敲除突變株的構(gòu)建與特性分析.pdf

1、在芽胞桿菌屬中，蠟樣芽胞桿菌群如炭疽芽胞桿菌、蠟樣芽胞桿菌、蘇云金芽胞桿菌等能夠在營養(yǎng)缺乏的不良環(huán)境中產(chǎn)生高度抗逆性的芽胞。芽胞最外層包裹著一層寬大、膨松的芽胞外壁，它對芽胞粘附、致病菌傳播、靶標(biāo)錨定及萌發(fā)調(diào)控起著一定作用。諸多研究曾致力于鑒定芽胞外壁蛋白質(zhì)，但目前為止只有少數(shù)被鑒定出，且它們在決定芽胞結(jié)構(gòu)和功能中的作用還知之甚少。
　　本研究以無晶體蘇云金芽胞桿菌8010為出發(fā)菌株，選用溫敏載體pRN5101，通過酶切、連接和P

2、CR，構(gòu)建了含芽胞外壁蛋白exp基因上游序列、卡納基因、exp基因下游序列的基因敲除載體pRN-ExpK。采用同源重組技術(shù)敲除了無晶體蘇云金芽胞桿菌8010芽胞外壁蛋白exp基因，成功獲得exp基因缺失突變株。通過測定生長曲線、芽胞抗逆性、疏水性、芽胞萌發(fā)及電子顯微鏡觀察等方法分析突變株與出發(fā)菌株的表型及性質(zhì)差異。結(jié)果表明，突變株生長速率低于出發(fā)菌株，芽胞熱抗性、溶菌酶及化學(xué)藥品抗性也有所下降。但疏水性實(shí)驗(yàn)表明，Exp蛋白對芽胞外壁表面

3、的疏水性和吸附特性影響不大。芽胞外壁除了具有防御功能外還可能有助于營養(yǎng)生長的恢復(fù)。為此，利用萌發(fā)劑L-丙氨酸、肌苷等誘導(dǎo)芽胞萌發(fā)結(jié)果表明，突變株芽胞萌發(fā)速率加快。此外，電子顯微鏡下突變株芽胞干癟褶皺，胞子僅松弛地結(jié)合在易碎的芽胞外壁上，部分芽胞外壁甚至完全脫離，呈碎片狀散落。這些結(jié)果證明芽胞外壁蛋白Exp作為芽胞外壁的組成成分，起到增強(qiáng)芽胞抗性、阻止芽胞過早萌發(fā)的作用，對形成強(qiáng)健的芽胞外壁具有重要意義。
　　本研究初步探討了芽胞理