濃縮生長因子纖維蛋白對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外增殖及分化的影響.pdf

1、目的:濃縮生長因子纖維蛋白(Concentrated Growth Factors，CGF)為自體血經(jīng)不間斷差速離心制備而成的富含多種高濃度生長因子的纖維蛋白，具有促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化、趨化和刺激血管化的功能，能夠加速軟硬組織修復(fù)，是再生醫(yī)療領(lǐng)域中的新技術(shù)。本實(shí)驗(yàn)以體外培養(yǎng)的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為研究對象，觀察CGF對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖及分化的影響，為CGF作為骨組織工程的生長因子源提供論實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:1、大鼠骨髓間

2、充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)
　　選取健康的4周齡雄性Wistar大鼠，在無菌條件下取其雙側(cè)脛骨和股骨，通過全骨髓貼壁法對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行分離、純化，收集第2～4代細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　2、大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定
　　(1)倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。
　　(2)采用免疫組化染色對細(xì)胞表面標(biāo)志物CD34、CD44進(jìn)行鑒定。
　　3、CGF的制備
　　選取健康的4周齡雄性Wistar大鼠，每只采集

3、靜脈血各5ml，放入真空采血管中，分別置于Medifiuge離心加速機(jī)的轉(zhuǎn)筒中，按照制備程序，制備出CGF。
　　4、實(shí)驗(yàn)分組
　?、偌?xì)胞增殖分為兩組:按基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入CGF與否，分為基礎(chǔ)培養(yǎng)基+CGF組和基礎(chǔ)培養(yǎng)基組（對照組），并選擇4個(gè)時(shí)間點(diǎn)(1d、3d、5d、7d)分別對比觀察兩組細(xì)胞增殖情況。②細(xì)胞分化分為四組:基礎(chǔ)培養(yǎng)基+CGF組、礦化誘導(dǎo)液組、礦化誘導(dǎo)液+CGF組和基礎(chǔ)培養(yǎng)基組（對照組），同樣選擇7d和14d兩

4、個(gè)時(shí)間點(diǎn)，對比觀察各時(shí)間點(diǎn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)情況。
　　5、應(yīng)用MTT方法檢測CGF對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖活性的影響。
　　6、應(yīng)用堿性磷酸酶試劑盒檢測成骨誘導(dǎo)各組細(xì)胞的堿性磷酸酶活性。
　　7、成骨誘導(dǎo)14天后，對實(shí)驗(yàn)各組進(jìn)行茜素紅染色和鈣化顆粒的半定量分析。
　　8、應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR的方法對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行成骨相關(guān)基因堿性磷酸酶(ALP)、Ⅰ-型膠原蛋白(Col-Ⅰ)、骨橋蛋白(OPN)、

5、骨鈣素(OCN)mRNA表達(dá)量的檢測。
　　9、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)結(jié)果均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，以P＜0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:1、本研究成功地應(yīng)用全骨髓貼壁法在體外分離培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，細(xì)胞大部分為長梭形，生長速度快，并以漩渦狀分布。免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示CD44染色陽性，CD34染色陰性。
　　2、離心后，可見真空采血管中血液分為三層，頂層

6、為貧血小板血漿，底部是紅細(xì)胞層，兩者之間為纖維蛋白凝膠層即CGF。
　　3、MTT結(jié)果顯示:經(jīng)過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，在第1天和第3天，基礎(chǔ)培養(yǎng)基+CGF組和對照組的吸光度值無顯著性差異（P＞0.05）;在第5天和第7天，基礎(chǔ)培養(yǎng)基+CGF組的吸光度值高于對照組，經(jīng)過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析存在顯著性差異（P＜0.05）。
　　4、堿性磷酸酶結(jié)果顯示，在第7天和14天，礦化誘導(dǎo)液+CGF組的ALP活性均高于其余三組，礦化誘導(dǎo)液組次之，對照組的ALP

7、活性最低，各組間兩兩比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　5、茜素紅染色及鈣化顆粒的半定量分析:
　　成骨誘導(dǎo)14d后，在倒置顯微鏡下能觀察到礦化顆粒的形成，并且礦化誘導(dǎo)液+CGF組所形成的顆粒數(shù)量最多，而對照組即基礎(chǔ)培養(yǎng)基組的礦化顆粒最少。此外，礦化顆粒經(jīng)氯化十六烷基吡啶溶解后，各組吸光度值（以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示）:基礎(chǔ)培養(yǎng)基+CGF組，0.6914±0.0136;礦化誘導(dǎo)液組，1.1607±0.0651;礦化誘導(dǎo)

8、液+CGF組，1.6685±0.0211;對照組，0.2102±0.0231，各組間兩兩比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　6、RT-PCR結(jié)果顯示，BMSCs在經(jīng)過誘導(dǎo)7d、14d后，礦化誘導(dǎo)液+CGF組的ALP、Col-Ⅰ、OPN、OCN等成骨相關(guān)基因的mRNA表達(dá)均明顯高于其它三組（P＜0.05）。無論是誘導(dǎo)培養(yǎng)7d還是14d，各組ALP、Col-Ⅰ、OPN、OCN的mRNA表達(dá)量均以礦化誘導(dǎo)液+CGF組最高，礦

9、化誘導(dǎo)液組次之，基礎(chǔ)培養(yǎng)基+CGF組再次之，對照組即基礎(chǔ)培養(yǎng)基組最低，各組間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:1、本實(shí)驗(yàn)成功分離培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。通過免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定，驗(yàn)證了所得細(xì)胞為間充質(zhì)干細(xì)胞。
　　2、CGF能明顯促進(jìn)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外的早期增殖。
　　3、CGF可以加強(qiáng)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基的成骨誘導(dǎo)能力，同時(shí)，其單獨(dú)應(yīng)用亦具有一定的成骨誘導(dǎo)能力。
　　4、CGF制取簡單