濃縮生長因子纖維蛋白對大鼠骨髓間充質干細胞體外增殖及分化的影響.pdf

1、目的:濃縮生長因子纖維蛋白(Concentrated Growth Factors，CGF)為自體血經不間斷差速離心制備而成的富含多種高濃度生長因子的纖維蛋白，具有促進細胞增殖、分化、趨化和刺激血管化的功能，能夠加速軟硬組織修復，是再生醫(yī)療領域中的新技術。本實驗以體外培養(yǎng)的大鼠骨髓間充質干細胞作為研究對象，觀察CGF對大鼠骨髓間充質干細胞增殖及分化的影響，為CGF作為骨組織工程的生長因子源提供論實驗依據。
　　方法:1、大鼠骨髓間

2、充質干細胞的分離培養(yǎng)
　　選取健康的4周齡雄性Wistar大鼠，在無菌條件下取其雙側脛骨和股骨，通過全骨髓貼壁法對大鼠骨髓間充質干細胞進行分離、純化，收集第2～4代細胞用于后續(xù)實驗。
　　2、大鼠骨髓間充質干細胞的鑒定
　　(1)倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)。
　　(2)采用免疫組化染色對細胞表面標志物CD34、CD44進行鑒定。
　　3、CGF的制備
　　選取健康的4周齡雄性Wistar大鼠，每只采集

3、靜脈血各5ml，放入真空采血管中，分別置于Medifiuge離心加速機的轉筒中，按照制備程序，制備出CGF。
　　4、實驗分組
　?、偌毎鲋撤譃閮山M:按基礎培養(yǎng)基中加入CGF與否，分為基礎培養(yǎng)基+CGF組和基礎培養(yǎng)基組（對照組），并選擇4個時間點(1d、3d、5d、7d)分別對比觀察兩組細胞增殖情況。②細胞分化分為四組:基礎培養(yǎng)基+CGF組、礦化誘導液組、礦化誘導液+CGF組和基礎培養(yǎng)基組（對照組），同樣選擇7d和14d兩

4、個時間點，對比觀察各時間點骨髓間充質干細胞成骨誘導情況。
　　5、應用MTT方法檢測CGF對大鼠骨髓間充質干細胞增殖活性的影響。
　　6、應用堿性磷酸酶試劑盒檢測成骨誘導各組細胞的堿性磷酸酶活性。
　　7、成骨誘導14天后，對實驗各組進行茜素紅染色和鈣化顆粒的半定量分析。
　　8、應用實時定量PCR的方法對大鼠骨髓間充質干細胞進行成骨相關基因堿性磷酸酶(ALP)、Ⅰ-型膠原蛋白(Col-Ⅰ)、骨橋蛋白(OPN)、

5、骨鈣素(OCN)mRNA表達量的檢測。
　　9、統(tǒng)計學分析
　　所有實驗數(shù)據均采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行分析，數(shù)據結果均以均數(shù)±標準誤表示，以P＜0.05認為具有統(tǒng)計學意義。
　　結果:1、本研究成功地應用全骨髓貼壁法在體外分離培養(yǎng)大鼠骨髓間充質干細胞，細胞大部分為長梭形，生長速度快，并以漩渦狀分布。免疫細胞化學染色顯示CD44染色陽性，CD34染色陰性。
　　2、離心后，可見真空采血管中血液分為三層，頂層

6、為貧血小板血漿，底部是紅細胞層，兩者之間為纖維蛋白凝膠層即CGF。
　　3、MTT結果顯示:經過統(tǒng)計學分析，在第1天和第3天，基礎培養(yǎng)基+CGF組和對照組的吸光度值無顯著性差異（P＞0.05）;在第5天和第7天，基礎培養(yǎng)基+CGF組的吸光度值高于對照組，經過統(tǒng)計學分析存在顯著性差異（P＜0.05）。
　　4、堿性磷酸酶結果顯示，在第7天和14天，礦化誘導液+CGF組的ALP活性均高于其余三組，礦化誘導液組次之，對照組的ALP

7、活性最低，各組間兩兩比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　5、茜素紅染色及鈣化顆粒的半定量分析:
　　成骨誘導14d后，在倒置顯微鏡下能觀察到礦化顆粒的形成，并且礦化誘導液+CGF組所形成的顆粒數(shù)量最多，而對照組即基礎培養(yǎng)基組的礦化顆粒最少。此外，礦化顆粒經氯化十六烷基吡啶溶解后，各組吸光度值（以均數(shù)±標準誤表示）:基礎培養(yǎng)基+CGF組，0.6914±0.0136;礦化誘導液組，1.1607±0.0651;礦化誘導

8、液+CGF組，1.6685±0.0211;對照組，0.2102±0.0231，各組間兩兩比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　6、RT-PCR結果顯示，BMSCs在經過誘導7d、14d后，礦化誘導液+CGF組的ALP、Col-Ⅰ、OPN、OCN等成骨相關基因的mRNA表達均明顯高于其它三組（P＜0.05）。無論是誘導培養(yǎng)7d還是14d，各組ALP、Col-Ⅰ、OPN、OCN的mRNA表達量均以礦化誘導液+CGF組最高，礦

9、化誘導液組次之，基礎培養(yǎng)基+CGF組再次之，對照組即基礎培養(yǎng)基組最低，各組間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　結論:1、本實驗成功分離培養(yǎng)大鼠骨髓間充質干細胞。通過免疫細胞化學染色鑒定，驗證了所得細胞為間充質干細胞。
　　2、CGF能明顯促進大鼠骨髓間充質干細胞體外的早期增殖。
　　3、CGF可以加強成骨誘導培養(yǎng)基的成骨誘導能力，同時，其單獨應用亦具有一定的成骨誘導能力。
　　4、CGF制取簡單