復方接骨中藥對骨髓間充質(zhì)干細胞體外增殖分化的影響及體內(nèi)應用.pdf

1、目的：復方接骨中藥臨床應用廣泛。大量臨床觀察表明，復方接骨中藥確能促進骨折及骨缺損愈合。本實驗通過中藥血清藥理學方法，觀察復方接骨中藥含藥血清對體外培養(yǎng)的大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞增殖、分化的影響以及含藥血清誘導的骨髓間充質(zhì)干細胞-去抗原牛松質(zhì)骨復合體在大鼠體內(nèi)的成骨潛能，旨在從細胞水平上探討復方接骨中藥促進骨愈合的作用機制，為接骨中藥的理論研究和臨床應用提供實驗依據(jù)。 方法：本復方接骨中藥由厚樸，大黃，枳殼，桃仁，蘇木，當歸，紅花，

2、骨碎補，川斷等組成，按體表面積折算為SD大鼠的等效劑量后，按中醫(yī)傳統(tǒng)方法煎制，灌喂實驗組。等量自來水微火加熱濃縮，灌喂對照組。取3月齡的雄性SD大鼠60只(體重240-260g)隨機分為實驗組與對照組，同等條件下分別連續(xù)灌喂10日。無菌條件下，股動脈放血處死大鼠，收集血液，室溫下離心，提取血清，滅活補體，制備出含藥血清及對照血清。另取體重250g的雄性SD大鼠1只斷髓法處死后無菌培養(yǎng)皿收取骨髓，用注射器反復抽吸后成為細胞懸液，接種于培養(yǎng)

3、瓶中，37℃，5％CO2，飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。培養(yǎng)3代以后的細胞用于實驗。實驗組細胞用10％含藥血清+DMEM培養(yǎng)，對照組細胞用10％非含藥血清+DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。每日于倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況及形態(tài)變化。用MTT法檢測細胞的增殖，麥胚凝集沉淀法骨堿性磷酸酶活力測定檢測細胞分化。取3月齡的雄性SD大鼠32只(體重240—260g)，隨機分為實驗組與對照組。實驗組將培養(yǎng)分化2w的骨髓MSC消化后制成均勻的細胞懸液，種植于預濕

4、的去抗原牛松質(zhì)骨，37℃，5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4h,待細胞基本貼壁后，再加入DMEM培養(yǎng)液2ml，繼續(xù)培養(yǎng)2h。將含藥血清培養(yǎng)誘導的骨髓MSC-BCB種植于大鼠皮下。對照組將不含含藥血清培養(yǎng)誘導的骨髓MSC的單純BCB直接種植于大鼠皮下。實驗組與對照組分別于術(shù)后14d和28d各取出8個植入物。取每個植入物的一半于4％多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋后切片，行HE染色，光鏡下觀察。另一半定量后勻漿，麥胚凝集沉淀法測定BALP活性。 結(jié)

5、果：1經(jīng)MTT法證實，實驗組及對照組細胞均先進入生長緩慢的滯留階段，該期約在傳代后24～72h。在第24h兩組無統(tǒng)計學差別(t=1.526，P＞0.05)，在第48h兩組無統(tǒng)計學差別(t=1.917,P＞0.05)。以后進入迅速增殖的指數(shù)生長期，該期約在傳代后72～120h，在72h、96h、120h時進行MTT試驗證明實驗組均比對照組增殖迅速(t=2.781，P＜0.05；t=3.412，P＜0.01；t=3.618，P＜0.01)。

6、120h后實驗組與對照組達到生長停止的平臺期。 2實驗組及對照組均是在第2w末時BALP活力達到高峰，第3w末開始明顯下降，在第1w末時實驗組與對照組無顯著性區(qū)別(t=2.093，p＞0.05)。在第2w末時BALP活力實驗組大于對照組(t=2.731，p＜0.05)，在第3w末時實驗組大于對照組(t=2.315，p＜0.05)，在第4w末時實驗組與對照組無顯著性區(qū)別(t=1.856，p＞0.05)。 3用10％含藥血清

7、+DMEM培養(yǎng)的實驗組細胞培養(yǎng)第1w末，增殖細胞呈簇集生長，細胞形態(tài)以梭形為主，以培養(yǎng)孔的周緣最為明顯；培養(yǎng)第2w末，細胞大量增殖，密度增高，細胞形態(tài)出現(xiàn)明顯變化，由單一的梭形纖維狀變成較多量的三角形、多角形、立方形細胞，完全具備成骨細胞形態(tài)。此時測定BALP活力達到高峰。MSC已大量誘導分化為成骨細胞。培養(yǎng)孔內(nèi)成骨細胞貼附成星形，突起向孔隙壁延伸。培養(yǎng)孔周緣的細胞已連接成片，形成細胞重疊，細胞分泌旺盛，胞體豐滿，胞漿透明清晰，貼壁牢固

8、，細胞突起增多，胞體間緊密連接，細胞之間界限模糊。以后細胞生長情況變化不大。對照組細胞培養(yǎng)誘導分化的成骨細胞數(shù)量、密度明顯較實驗組下降，同期細胞BALP活力較低。 4誘導后大鼠骨髓MSC-BCB的組織學觀察實驗組與對照組明顯不同。實驗組誘導后的骨髓MSC數(shù)量較多，附于BCB骨小梁表面上，細胞核染成藍色，呈圓形和橢圓形，見到新骨發(fā)生。對照組細胞體積較大，呈梭形，有突起，個別細胞呈三角形或多角形。骨小梁間隙可見纖維組織，未見新骨發(fā)生

9、。統(tǒng)計學分析表明植入物實驗組BALP活性顯著高于對照組。14d：t=8.85，p＜0.01；28d：t=8.37，p＜0.01。 結(jié)論：1復方接骨中藥可以促進體外培養(yǎng)的骨髓MSC增殖及向成骨細胞方向分化。 2復方接骨中藥含藥血清體外誘導的骨髓MSC-BCB復合體具有體內(nèi)成骨作用。 3組方合理的接骨中藥能夠促進骨愈合。 4中藥血清藥理學方法可以客觀反映中藥藥效。 5本實驗方法可以驗證接骨中藥組方的合