復(fù)方接骨中藥對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外增殖分化的影響及體內(nèi)應(yīng)用.pdf

1、目的：復(fù)方接骨中藥臨床應(yīng)用廣泛。大量臨床觀察表明，復(fù)方接骨中藥確能促進(jìn)骨折及骨缺損愈合。本實(shí)驗(yàn)通過中藥血清藥理學(xué)方法，觀察復(fù)方接骨中藥含藥血清對體外培養(yǎng)的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖、分化的影響以及含藥血清誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞-去抗原牛松質(zhì)骨復(fù)合體在大鼠體內(nèi)的成骨潛能，旨在從細(xì)胞水平上探討復(fù)方接骨中藥促進(jìn)骨愈合的作用機(jī)制，為接骨中藥的理論研究和臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：本復(fù)方接骨中藥由厚樸，大黃，枳殼，桃仁，蘇木，當(dāng)歸，紅花，

2、骨碎補(bǔ)，川斷等組成，按體表面積折算為SD大鼠的等效劑量后，按中醫(yī)傳統(tǒng)方法煎制，灌喂實(shí)驗(yàn)組。等量自來水微火加熱濃縮，灌喂對照組。取3月齡的雄性SD大鼠60只(體重240-260g)隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組與對照組，同等條件下分別連續(xù)灌喂10日。無菌條件下，股動脈放血處死大鼠，收集血液，室溫下離心，提取血清，滅活補(bǔ)體，制備出含藥血清及對照血清。另取體重250g的雄性SD大鼠1只斷髓法處死后無菌培養(yǎng)皿收取骨髓，用注射器反復(fù)抽吸后成為細(xì)胞懸液，接種于培養(yǎng)

3、瓶中，37℃，5％CO2，飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。培養(yǎng)3代以后的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞用10％含藥血清+DMEM培養(yǎng)，對照組細(xì)胞用10％非含藥血清+DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。每日于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況及形態(tài)變化。用MTT法檢測細(xì)胞的增殖，麥胚凝集沉淀法骨堿性磷酸酶活力測定檢測細(xì)胞分化。取3月齡的雄性SD大鼠32只(體重240—260g)，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組與對照組。實(shí)驗(yàn)組將培養(yǎng)分化2w的骨髓MSC消化后制成均勻的細(xì)胞懸液，種植于預(yù)濕

4、的去抗原牛松質(zhì)骨，37℃，5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4h,待細(xì)胞基本貼壁后，再加入DMEM培養(yǎng)液2ml，繼續(xù)培養(yǎng)2h。將含藥血清培養(yǎng)誘導(dǎo)的骨髓MSC-BCB種植于大鼠皮下。對照組將不含含藥血清培養(yǎng)誘導(dǎo)的骨髓MSC的單純BCB直接種植于大鼠皮下。實(shí)驗(yàn)組與對照組分別于術(shù)后14d和28d各取出8個植入物。取每個植入物的一半于4％多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋后切片，行HE染色，光鏡下觀察。另一半定量后勻漿，麥胚凝集沉淀法測定BALP活性。 結(jié)

5、果：1經(jīng)MTT法證實(shí)，實(shí)驗(yàn)組及對照組細(xì)胞均先進(jìn)入生長緩慢的滯留階段，該期約在傳代后24～72h。在第24h兩組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差別(t=1.526，P＞0.05)，在第48h兩組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差別(t=1.917,P＞0.05)。以后進(jìn)入迅速增殖的指數(shù)生長期，該期約在傳代后72～120h，在72h、96h、120h時進(jìn)行MTT試驗(yàn)證明實(shí)驗(yàn)組均比對照組增殖迅速(t=2.781，P＜0.05；t=3.412，P＜0.01；t=3.618，P＜0.01)。

6、120h后實(shí)驗(yàn)組與對照組達(dá)到生長停止的平臺期。 2實(shí)驗(yàn)組及對照組均是在第2w末時BALP活力達(dá)到高峰，第3w末開始明顯下降，在第1w末時實(shí)驗(yàn)組與對照組無顯著性區(qū)別(t=2.093，p＞0.05)。在第2w末時BALP活力實(shí)驗(yàn)組大于對照組(t=2.731，p＜0.05)，在第3w末時實(shí)驗(yàn)組大于對照組(t=2.315，p＜0.05)，在第4w末時實(shí)驗(yàn)組與對照組無顯著性區(qū)別(t=1.856，p＞0.05)。 3用10％含藥血清

7、+DMEM培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞培養(yǎng)第1w末，增殖細(xì)胞呈簇集生長，細(xì)胞形態(tài)以梭形為主，以培養(yǎng)孔的周緣最為明顯；培養(yǎng)第2w末，細(xì)胞大量增殖，密度增高，細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)明顯變化，由單一的梭形纖維狀變成較多量的三角形、多角形、立方形細(xì)胞，完全具備成骨細(xì)胞形態(tài)。此時測定BALP活力達(dá)到高峰。MSC已大量誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞。培養(yǎng)孔內(nèi)成骨細(xì)胞貼附成星形，突起向孔隙壁延伸。培養(yǎng)孔周緣的細(xì)胞已連接成片，形成細(xì)胞重疊，細(xì)胞分泌旺盛，胞體豐滿，胞漿透明清晰，貼壁牢固

8、，細(xì)胞突起增多，胞體間緊密連接，細(xì)胞之間界限模糊。以后細(xì)胞生長情況變化不大。對照組細(xì)胞培養(yǎng)誘導(dǎo)分化的成骨細(xì)胞數(shù)量、密度明顯較實(shí)驗(yàn)組下降，同期細(xì)胞BALP活力較低。 4誘導(dǎo)后大鼠骨髓MSC-BCB的組織學(xué)觀察實(shí)驗(yàn)組與對照組明顯不同。實(shí)驗(yàn)組誘導(dǎo)后的骨髓MSC數(shù)量較多，附于BCB骨小梁表面上，細(xì)胞核染成藍(lán)色，呈圓形和橢圓形，見到新骨發(fā)生。對照組細(xì)胞體積較大，呈梭形，有突起，個別細(xì)胞呈三角形或多角形。骨小梁間隙可見纖維組織，未見新骨發(fā)生

9、。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明植入物實(shí)驗(yàn)組BALP活性顯著高于對照組。14d：t=8.85，p＜0.01；28d：t=8.37，p＜0.01。 結(jié)論：1復(fù)方接骨中藥可以促進(jìn)體外培養(yǎng)的骨髓MSC增殖及向成骨細(xì)胞方向分化。 2復(fù)方接骨中藥含藥血清體外誘導(dǎo)的骨髓MSC-BCB復(fù)合體具有體內(nèi)成骨作用。 3組方合理的接骨中藥能夠促進(jìn)骨愈合。 4中藥血清藥理學(xué)方法可以客觀反映中藥藥效。 5本實(shí)驗(yàn)方法可以驗(yàn)證接骨中藥組方的合