骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外定向分化為神經(jīng)樣細(xì)胞的研究.pdf

1、脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)后所引起的神經(jīng)源性膀胱癥狀嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，但目前尚無(wú)有效的治療手段，并且多數(shù)研究集中在尿流動(dòng)力學(xué)及神經(jīng)功能損傷等方面。隨著近年來(lái)干細(xì)胞研究的突飛猛進(jìn)，干細(xì)胞移植用于治療血液系統(tǒng)惡性腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫疾病并取得有效成果，甚至已經(jīng)應(yīng)用于臨床，這使通過(guò)干細(xì)胞聯(lián)合組織工程移植增加脊髓神經(jīng)數(shù)量、減少膠質(zhì)瘢痕和空洞的形成成為可能，采用干細(xì)胞接種至組織工程進(jìn)行移植可望成為一種有效治療

2、SCI后神經(jīng)源性膀胱的新方法。然而，在組織工程構(gòu)建中選擇合適的種子細(xì)胞成為治療的重要環(huán)節(jié)。全能干細(xì)胞和多能干細(xì)胞具有高度自我更新能力和多向分化的潛能，是組織工程中重要的靶細(xì)胞。胚胎干細(xì)胞移植存在倫理道德和免疫排斥等問(wèn)題，神經(jīng)干細(xì)胞、嗅鞘細(xì)胞及雪旺細(xì)胞的來(lái)源均有限，且取材不便，很難應(yīng)用于臨床。BMSCs在體外具有強(qiáng)大的增殖能力，而且可以在不同的理化環(huán)境和細(xì)胞因子的誘導(dǎo)下向骨、脂肪、腱和肌肉等組織分化，還可以跨胚胎分化為神經(jīng)組織，展示出良好

3、的研究和應(yīng)前用景。
　　 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?br>　　 通過(guò)對(duì)SD大鼠BMSCs的體外分離純化和培養(yǎng)擴(kuò)增，采用免疫熒光染色法對(duì)BMSCs進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察及表型鑒定，并利用其生物學(xué)特性進(jìn)行Nestin免疫細(xì)胞化學(xué)分析、誘導(dǎo)分化及分化鑒定，探討B(tài)MSCs定向分化為神經(jīng)樣細(xì)胞的潛能，為利用BMSCs治療SCI所引起的神經(jīng)源性膀胱提供一種理想的種子細(xì)胞和一定的理論依據(jù)。
　　 實(shí)驗(yàn)方法：
　　 1.采用全骨髓貼壁分離法體外提取

4、、分離及純化大鼠BMSCs，并進(jìn)行傳代擴(kuò)增；
　　 2.繪制BMSCs的生長(zhǎng)曲線，并進(jìn)行免疫熒光染色觀察其形態(tài)結(jié)構(gòu)；
　　 3.流式細(xì)胞分析儀檢測(cè)細(xì)胞表面抗原CD29、CD34、CD105的陽(yáng)性表達(dá)率；
　　 4.在成骨細(xì)胞誘導(dǎo)劑和神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)劑條件下定向誘導(dǎo)BMSCs向成骨細(xì)胞和神經(jīng)樣細(xì)胞分化,并分別行茜素紅、Nestin免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定；
　　 5.將誘導(dǎo)形成的神經(jīng)球樣細(xì)胞團(tuán)進(jìn)一步培養(yǎng)分化，并進(jìn)行

5、MAP-2、GFAP免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定分化形成的神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　 1.全骨髓貼壁分離法獲得的BMSCs在接種后24～36小時(shí)貼壁，梭形，核質(zhì)比大，呈漩渦狀生長(zhǎng)，增殖能力強(qiáng)；
　　 2.細(xì)胞生長(zhǎng)經(jīng)過(guò)潛伏適應(yīng)期、對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期、平臺(tái)期階段；免疫熒光染色后在熒光顯微鏡下可見(jiàn)全部細(xì)胞均呈綠色熒光，細(xì)胞為梭形或多邊形，細(xì)胞核未染熒光，保持了良好的形態(tài)；
　　 3.流式細(xì)胞分析儀顯示P

6、3～P5代細(xì)胞表面抗原CD29、CD105表達(dá)陽(yáng)性，而CD34表達(dá)陰性；
　　 4.在兩種不同誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)下BMSCs能分化形成成骨細(xì)胞和神經(jīng)樣細(xì)胞并表達(dá)相應(yīng)的特異性抗原；
　　 5.進(jìn)一步培養(yǎng)分化所形成的細(xì)胞能表達(dá)神經(jīng)元標(biāo)志物MAP-2或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP。
　　 結(jié)論：
　　 1.全骨髓貼壁分離法可分離出較純的BMSCs,經(jīng)培養(yǎng)擴(kuò)增后能獲取大量的BMSCs，細(xì)胞呈貼壁生長(zhǎng)，增殖能力強(qiáng)；