肝細(xì)胞生長因子轉(zhuǎn)染的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)腎間質(zhì)纖維化的影響.pdf

1、第一部分：攜帶肝細(xì)胞生長因子的腺病毒在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞的表達(dá)。 目的：將帶有肝細(xì)胞生長因子(HGF)及綠色熒光蛋白(GFP)基因的腺病毒載體，感染大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)，觀察其感染率及HGF的表達(dá)。 方法：將構(gòu)建好的攜帶HGF基因的腺病毒載體(Ad-HGF)和攜帶GFP基因的腺病毒載體(Ad-GFP)進(jìn)行體外擴(kuò)增、病毒滴度測(cè)定；貼壁細(xì)胞分離法和密度梯度離心法相結(jié)合體外分離、純化大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，并通過流

2、式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面抗原CD11b/c、CD34、CD44、CD90和CD29；將帶有GFP的腺病毒載體感染MSCs，免疫熒光顯微鏡測(cè)定含HGF基因的重組腺病毒(Ad-HGF)對(duì)MSCs感染率；ELISA和RT-PCR檢測(cè)HGF在MSCs中的表達(dá)。 結(jié)果：病毒擴(kuò)增后噬斑試驗(yàn)測(cè)定Ad-GFP的病毒滴度為8.3×1010 pfu/ml，Ad-HGF的病毒滴度為1.6×109 pfu/ml。大鼠MSCs傳代后細(xì)胞均一性好、純度高，呈長

3、梭樣，放射狀或柵欄樣生長，MSCs表面特異性抗原CD29、CD90、CD44表達(dá)陽性，而CD34、CD11b為陰性表達(dá)；隨著病毒感染復(fù)數(shù)(MOI值)的增大，重組腺病毒對(duì)MSCs的轉(zhuǎn)染效率增加，當(dāng)MOI值為150時(shí)，轉(zhuǎn)染率為100％；ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示：Ad-HGF感染MSCs第8天，HGF表達(dá)含量達(dá)到峰值(22ng/ml)，16天時(shí)，仍可檢測(cè)到HGF；RT-PCR結(jié)果示：Ad-HGF感染MSCs第11天時(shí)同樣仍可觀察到HGFmRNA

4、的表達(dá)。 結(jié)論：①通過貼壁細(xì)胞分離法、密度梯度離心法及流式細(xì)胞儀可分離、純化并鑒定大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。②腺病毒對(duì)MSCs有較高的轉(zhuǎn)染效率。③Ad-HGF感染MSCs后，HGF可有效表達(dá)。 目的：探討Ad-HGF轉(zhuǎn)染的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)大鼠腎間質(zhì)纖維化的影響及可能機(jī)制。 方法：建立UUO大鼠模型，隨機(jī)分為UUO組、Ad-HGF修飾MSCs移植組、假手術(shù)組，并于術(shù)后3、7、14、28 d檢測(cè)血肌酐(Scr)、尿

5、素氮(BUN)，免疫組化測(cè)腎組織HGF、a-平滑肌肌動(dòng)蛋白(a-SMA)的表達(dá)，HE染色觀察腎組織的病理改變，冰凍切片熒光顯微鏡下觀察移植細(xì)胞在腎組織的定位，RT-PCR法檢測(cè)纖維連接蛋白(FN)和a-SMA mRNA的表達(dá)。 結(jié)果：在移植術(shù)后3、7、14 d大鼠腎臟冰凍切片上可以見到DAPI標(biāo)記的移植細(xì)胞；與假手術(shù)組相比，術(shù)后第7d，UUO組、移植組Scr、BUN值顯著升高，術(shù)后第14d，UUO組、移植組Scr、BUN值下降但

6、仍明顯高于假手術(shù)組(P＜0.05)，UUO組、移植組之間無顯著差異(P＞0.05)；術(shù)后第28d，移植組Scr值低于UUO組(P＜0.05)。與假手術(shù)組相比，UUO組、移植組a-SMA表達(dá)增高，移植組HGF表達(dá)較UUO顯著增加。隨著梗阻時(shí)間的延長，F(xiàn)N、a-SMA mRNA的表達(dá)逐漸增加(P＜0.05)，術(shù)后第14d，移植組a-SMA mRNA的表達(dá)低于UUO組(P＜0.05)；術(shù)后第28d，移植組FN、a-SMA mRNA的表達(dá)均低于