薯蕷皂苷對大鼠H9c2心肌細胞缺氧-復氧損傷的保護作用.pdf

1、目的：
　　 研究薯蕷皂苷(dioscin，Dio)對大鼠H9c2心肌細胞缺氧/復氧損傷的保護作用機制。
　　 方法：
　　 建立大鼠H9c2心肌細胞缺氧/復氧損傷模型，并用薯蕷皂苷進行干預。將培養(yǎng)的大鼠H9c2心肌細胞隨機分為5組，正常對照組(C組)；缺氧/復氧模型組(H/R組)；缺氧/復氧模型+薯蕷皂苷低、中、高劑量(10mg/L、20 mg/L、40mg/L)干預組(H/R+L、M、H組)。
　　

2、1.用甲基噻唑基四唑(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)法測定細胞存活率。
　　 2.收集培養(yǎng)細胞上清液，分別測定乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)的活性及丙二醛(malondialdehyde，MDA)的含量。
　　 3.應(yīng)用熒光探針DCFH-DA標記細胞內(nèi)的活性氧(reactive oxy

3、gen species，ROS)，熒光顯微鏡下觀察各組心肌細胞內(nèi)活性氧水平。
　　 4.采用碘化丙啶(propidium iodide，PI)染色法，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。
　　 5.用羅丹明123((Rhodamine123，Rh123)熒光探針標記線粒體，多功能標記儀檢測熒光強度以反映細胞線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，△Ψm)的變化。
　　 6.采用酶聯(lián)免

4、疫吸附測定法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)檢測細胞內(nèi)細胞色素C(cytochrome C，Cyt-c)釋放量。
　　 7.應(yīng)用RT-PCR方法檢測細胞凋亡相關(guān)基因Bax、Bcl-2、caspase-9、caspase-3mRNA的表達。
　　 8.應(yīng)用Western blot法檢測熱休克蛋白70(heat-shock protein70，HSP70)的表達。結(jié)果

5、　　 1.細胞存活率：與H/R組比較，C組心肌細胞存活率有統(tǒng)計學差異(34.50±8.50％vs100.00±00.00％，P<0.01)，H/R+L、M、H三組，均可明顯升高心肌細胞存活率(34.50±8.50％vs66.47±10.56％，76.19±7.57％，93.38±6.09％，P<0.01)；且與H/R+H組比較，H/R+L、M組有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。
　　 2.LDH活性：與H/R組比較，C組心肌細胞L

6、DH活性有統(tǒng)計學差異(1287.68±58.97 U/L vs975.29±35.66 U/L，P<0.01)，H/R+L、M、H三組，均可明顯降低心肌細胞LDH活性(1287.68±58.97 U/L vs1150.85±40.67 U/L，1078.79±48.94 U/L，1001.65±53.05 U/L，P<0.01)；且與H/R+H組比較，H/R+L、M組有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。
　　 SOD活性：與H/R組比

7、較，C組心肌細胞SOD活性有統(tǒng)計學差異(17.36±1.12 U/mlvs23.55±1.19 U/ml.P<0.01)，H/R+L、M、H三組，均可明顯升高心肌細胞SOD活性(17.36±1.12 U/ml vs19.59±0.60 U/ml，21.08±0.63 U/ml，22.56±0.59 U/ml，P<0.01)；且與H/R+H組比較，H/R+L組有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。
　　 MDA含量：與H/R組比較，C組心

8、肌細胞MDA含量有統(tǒng)計學差異(2.88±0.04 nmol/ml vs2.49±0.03 nmol/ml，P<0.01)，H/R+L、M、H三組，均可明顯降低心肌細胞MDA含量(2.88±0.04 nmol/ml vs2.72±0.06 nmol/ml，2.66±0.05nmol/ml.2.59±0.03 nmol/ml，P<0.01)；且與H/R+H組比較，H/R+L、M組有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。
　　 3.活性氧：熒光

9、顯微鏡下，Rosup活性氧陽性對照組熒光強度最高，H/R組熒光強度較高，與H/R組比較，H/R+L、H/R+M、H/R+H組均可降低細胞熒光強度、減低細胞內(nèi)活性氧水平。
　　 4.細胞凋亡率：與H/R組比較，C組心肌細胞凋亡率有統(tǒng)計學差異(10.61±1.00％vs0.15±0.04％，P<0.01)，H/R+L、M、H三組，均可明顯減低心肌細胞凋亡率(10.61±1.00％vs2.03±0.06％，1.80±0.06％，1.6

10、7±0.04％，P<0.01)；且與H/R+H組比較，H/R+L、M組有統(tǒng)計學差異(P<0.05，P<0.01)。
　　 5.△Ψm熒光強度：與H/R組比較，C組心肌細胞線粒體膜電位有統(tǒng)計學差異(106547±5907 vs205486±4653，P<0.01)，H/R+L、M、H三組，均可明顯升高心肌細胞線粒體膜電位(106547±5907vs160835±3521，186350±3353，194694±3043，P<0.01

11、)；且與H/R+H組比較，H/R+L、M組有統(tǒng)計學差異(P<0.01)。
　　 6.Cyt-c釋放量：與H/R組比較，C組細胞內(nèi)Cyt-c量差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，薯蕷皂苷干預的三組H/R+L、H/R+M、H/R+H組，均可減少心肌細胞線粒體內(nèi)Cyt-c釋放量(P<0.01)；與H/R+H組比較，H/R+L組(P<0.05)，各給藥組的作用呈顯著濃度相關(guān)性。
　　 7.Bax、Bcl-2 mRNA的表達：與H

12、/R組比較，C組細胞Bax、Bcl-2 mRNA的表達差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，薯蕷皂苷干預的三組H/R+L、H/R+M、H/R+H組，均可減少心肌細胞Bax mRNA的表達(P<0.01)，并能升高Bcl-2 mRNA的表達(P<0.05)；與H/R+H組比較，H/R+L組(P<0.05)，各給藥組的作用呈顯著濃度相關(guān)性。
　　 caspase-9、caspase-3 mRNA的表達：與H/R組比較，C組細胞casp

13、ase-9、caspase-3 mRNA的表達差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，薯蕷皂苷干預的三組H/R+L、H/R+M、H/R+H組，均可減少心肌細胞caspase-9、caspase-3 mRNA的表達(P<0.01)；與H/R+H組比較，H/R+L組(P<0.01)，各給藥組的作用呈顯著濃度相關(guān)性。
　　 8.HSP70的表達：與H/R組比較，C組細胞HSP70的表達差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，薯蕷皂苷干預的三組

14、H/R+L、H/R+M、H/R+H組，均可明顯升高心肌細胞內(nèi)HSP70的表達(P<0.05)；與H/R+H組比較，H/R+L組(P<0.01)，各給藥組的作用呈顯著濃度相關(guān)性。
　　 結(jié)論：
　　 1.薯蕷皂苷可有效減少缺氧/復氧損傷的大鼠H9c2心肌細胞LDH漏出量，提高細胞存活率。
　　 2.薯蕷皂苷可通過抗氧化作用有效保護缺氧/復氧對大鼠H9c2心肌細胞的損傷。
　　 3.薯蕷皂苷可通過抗凋亡作用有