腎素（前體）受體在H9c2心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、心肌梗死的臨床研究已余百年，雖已取得迅猛卓著進(jìn)展，但其治療仍是心血管醫(yī)生面臨的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。經(jīng)皮冠狀動脈介入治療(PCI)是急性心梗再灌注治療的主要措施，且安全有效。但冠脈再通后常會出現(xiàn)心肌缺血再灌注損傷(IschamicReperfusion Injury，IRI)，臨床表現(xiàn)為急性心肌梗死患者冠脈再通，梗死心肌再灌注后一段時間，有的患者卻出現(xiàn)心律失常、心力衰竭甚至心源性猝死等一系列病情反而惡化的表現(xiàn)，嚴(yán)重影響患者預(yù)后，成為目前阻礙急性心梗

2、患者急診再灌注治療獲益的主要難題。IRI是臨床常見的病理生理過程，但其機(jī)制尚未完全闡明。研究認(rèn)為，氧自由基增加、鈣超載、心肌能量代謝異常、中性粒細(xì)胞激活、血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙等均參與了心肌IRI，并互為因果，最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡和壞死。在心肌IRI中，細(xì)胞凋亡起到了重要作用，介導(dǎo)心肌IRI細(xì)胞凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑復(fù)雜多樣，也是目前的研究熱點(diǎn)之一。深入了解心肌IRI及其致心肌細(xì)胞凋亡的分子生物學(xué)機(jī)制，阻斷促發(fā)心肌IRI特別是細(xì)胞凋亡的信號轉(zhuǎn)

3、導(dǎo)通路，抑制心肌IRI，減少心肌細(xì)胞的缺失，改善心臟功能具有極其重要的臨床意義。近年來研究證實(shí)腎素—血管緊張素系統(tǒng)(renin angiotensin system，RAS)的激活參與心肌缺血再灌注損傷的病理生理過程，心肌組織中血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)水平的升高加重了心肌缺血再灌注損傷，減少AngⅡ的生成或拮抗其作用對心肌有保護(hù)作用。腎素前體及其受體作為RAS系統(tǒng)的新成員，隨著其逐漸在不同組織器官中均被發(fā)現(xiàn)而引起研究者重視。腎素（前體）

4、受體(P) RR作為腎素及其前體的共同受體，于2002年首次被發(fā)現(xiàn)，(P) RR除了能激活腎素前體使其具有酶的活性外，還具有激活細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的作用。目前的研究已證實(shí)腎素（前體）與受體結(jié)合，激活ERK1/2、p38 MAPK及PI3K/AKT等信號通路，造成血管內(nèi)皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞及腎臟系膜細(xì)胞損傷，在糖尿病腎病，高血壓及其他心血管及腎臟疾病的病理生理過程中起到了重要的作用。但(P) RR在心肌IRI中的作用目前尚無人研究。本研究擬從

5、細(xì)胞水平，應(yīng)用H9c2胚胎大鼠心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧(hypoxia/reoxygenation)損傷模型模擬在體IRI損傷，檢測H9c2心肌細(xì)胞(P) RR的表達(dá)，應(yīng)用siRNA干擾(P) RR及聯(lián)合p38MAPK阻斷劑，研究(P) RR介導(dǎo)的缺氧復(fù)氧所致H9c2心肌細(xì)胞凋亡及炎癥反應(yīng)的作用及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。
　　第一部分，缺氧復(fù)氧導(dǎo)致腎素（前體）受體在H9c2胚胎大鼠心肌細(xì)胞中的表達(dá)變化
　　目的:
　　1.驗(yàn)證H9c2胚

6、胎大鼠心肌細(xì)胞系中是否有(P) RR表達(dá)。
　　2.檢測siRNA干擾(P) RR效率。
　　3.明確缺氧復(fù)氧所致(P) RR蛋白表達(dá)的變化，并進(jìn)一步確定使(P) RR蛋白表達(dá)最大的復(fù)氧時間。
　　方法:
　　1.H9c2細(xì)胞培養(yǎng)及傳代。
　　2.應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)和免疫熒光方法檢測H9c2細(xì)胞中(P) RR的表達(dá)，并結(jié)合RT-PCR半定量檢測(P) RR mRNA的表達(dá)。
　　3.檢測siRNA干擾(

7、P) RR的效率:設(shè)計三條siRNA引物siRNA653，siRNA132和siRNA965，采用real time PCR和Western blot法檢測siRNA轉(zhuǎn)染組及對照組中H9c2心肌細(xì)胞的干擾目的基因的mRNA和蛋白表達(dá)水平，以判斷相應(yīng)siRNA的抑制效能。
　　4.缺氧復(fù)氧所致(P) RR蛋白表達(dá)變化的檢測。實(shí)驗(yàn)分組:正常氧對照組(Normoxia)，缺氧2小時組(2H)，缺氧2小時復(fù)氧2小時組(2H/2R)，缺氧2

8、小時復(fù)氧3小時組(2H/3R)，缺氧2小時復(fù)氧6小時組(2H/6R)，缺氧2小時復(fù)氧12小時組(2H/12R)。應(yīng)用Western blot方法測定(P) RR蛋白表達(dá)變化。
　　結(jié)果:
　　1.(P)RR在H9c2胚胎大鼠心肌細(xì)胞中的表達(dá):免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示H9c2胚胎大鼠心肌細(xì)胞呈長梭形。免疫熒光結(jié)果顯示:細(xì)胞中(P) RR表達(dá)為綠色熒光標(biāo)記，(P) RR蛋白主要分布在H9c2細(xì)胞的細(xì)胞膜、胞漿和細(xì)胞核膜。RT-PCR

9、結(jié)果顯示H9c2細(xì)胞中有(P) RR基因表達(dá)特異性條帶出現(xiàn)，分子量為275bp。
　　2.(P)RR干擾效率的檢測結(jié)果:三種siRNA干擾均可顯著減少(P)RR mRNA和蛋白表達(dá)水平，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇抑制效果最顯著的siRNA965。
　　3.缺氧復(fù)氧致(P) RR蛋白表達(dá)的變化:與Normoxia組比較，2H組(P) RR蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，2H/3R組較2H組無顯著變化，2H/6R組(P) RR蛋白表達(dá)進(jìn)一步顯著上調(diào)，2H/

10、12R組(P) RR蛋白表達(dá)較2H/6R組有所降低。故提示2H/6R組(P) RR蛋白表達(dá)量達(dá)峰。后續(xù)實(shí)驗(yàn)復(fù)氧時間為6小時。
　　結(jié)論:
　　1、(P) RR存在于H9c2胚胎大鼠心肌細(xì)胞中。
　　2、siRNA干擾可有效的抑制(P) RR mRNA和蛋白表達(dá)水平。
　　3、缺氧復(fù)氧可致H9c2細(xì)胞(P) RR蛋白表達(dá)顯著增高，2H/6R組蛋白表達(dá)達(dá)峰。
　　第二部分，缺氧復(fù)氧所致H9c2胚胎大鼠心肌細(xì)胞凋

11、亡及炎癥反應(yīng)
　　目的:
　　檢測缺氧2小時及再復(fù)氧6小時，H9c2心肌細(xì)胞凋亡及炎癥因子表達(dá)的變化。
　　方法:
　　1.實(shí)驗(yàn)分組:正常氧對照組(Normoxia組)，缺氧2小時組（2H組），缺氧2小時再復(fù)氧6小時組（2H/6R組）。
　　2.利用Annexin V-FITC/PI雙染法，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡率。
　　3.Western blot方法檢測Caspase-3蛋白表達(dá)量。

12、>　　4.應(yīng)用ELISA方法檢測H9c2心肌細(xì)胞上清液中炎癥因子IL-6、TNF-a、TGF-β的濃度。
　　結(jié)果:
　　1.細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果顯示:H9c2細(xì)胞經(jīng)歷缺氧2小時的凋亡率為31.98％，較Normoxia組顯著增加;2H/6R組的凋亡率為40.21％，較2H組進(jìn)一步顯著增加。
　　2.Western blot結(jié)果顯示:與Normoxia組相比，2H組凋亡因子Caspase-3相對蛋白表達(dá)量顯著增高，2H/6

13、R組Caspase-3蛋白表達(dá)進(jìn)一步顯著上調(diào)。
　　3.ELISA方法結(jié)果顯示:與Normoxia組相比，2H組細(xì)胞上清液炎癥因子IL-6、TNF-a、TGF-β的濃度均顯著上調(diào)，2H/6R組炎癥因子IL-6、TNF-a、TGF-β的濃度進(jìn)一步顯著上調(diào)。
　　結(jié)論:
　　1.缺氧2小時，H9c2心肌細(xì)胞凋亡率及Caspase-3蛋白表達(dá)顯著增加，再復(fù)氧6小時上述凋亡指標(biāo)進(jìn)一步增加。
　　2.缺氧2小時，H9c2心

14、肌細(xì)胞分泌炎癥因子TNF-a，IL-6和TGF-β明顯增加，再復(fù)氧6小時炎癥因子分泌進(jìn)一步增加。
　　第三部分，腎素（前體）受體介導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制
　　目的:
　　利用siRNA干擾及聯(lián)合p38MAPK抑制劑，從p38MAPK途徑初步探討(P) RR介導(dǎo)的缺氧復(fù)氧所致H9c2心肌細(xì)胞凋亡及炎癥反應(yīng)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。
　　方法:
　　1.實(shí)驗(yàn)分組:根據(jù)缺氧復(fù)氧干預(yù)分組:正常氧對照組

15、(Normoxia);缺氧2小時組(2H);缺氧2小時復(fù)氧6小時組(2H/6R)。根據(jù)阻斷(P) RR及其信號通路分組:對照組(Control); siRNA干擾(P) RR組，即siRNA(+)組;只加入lipo2000的siRNA陰性對照組，即siRNA（-）組;加入P38阻斷劑組SB203580，即SB203580組;加入lipo2000和SB203580組，即siRNA（-）+SB203580組;siRNA干擾(P) RR同時加

16、入SB203580組，即siRNA(+)+SB203580組。
　　2.Western blot方法檢測p-p38及Caspase-3蛋白表達(dá)量。
　　3.應(yīng)用ELISA方法檢測H9c2心肌細(xì)胞上清液中炎癥因子IL-6、TNF-a、TGF-β的濃度。
　　結(jié)果:
　　1.Western blot結(jié)果顯示:siRNA干擾(P) RR或加用p38MAPK抑制劑SB203580均可使p-p38蛋白表達(dá)下調(diào);siRNA干

17、擾(P) RR聯(lián)合p38阻斷劑SB203580使p-p38蛋白表達(dá)進(jìn)一步下調(diào)，提示p38MAPK活化至少部分通過(P) RR介導(dǎo)。
　　2.缺氧復(fù)氧致p38MAPK磷酸化水平增加，siRNA干擾(P) RR單獨(dú)或聯(lián)用p38阻斷劑SB203580可部分抑制缺氧復(fù)氧所致的p-p38MAPK的蛋白表達(dá)的上調(diào)。
　　3.siRNA干擾(P) RR單獨(dú)或合并阻斷p-p38MAPK使Caspase-3蛋白表達(dá)下調(diào)。
　　4.siR