白藜蘆醇后處理對(duì)缺氧-復(fù)氧H9C2心肌細(xì)胞鈣超載的保護(hù)效應(yīng)及作用機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　本研究擬從細(xì)胞水平上探討:1.建立體外H9C2心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型以模擬體內(nèi)缺血再灌注損傷，從細(xì)胞水平探討不同濃度的白藜蘆醇后處理對(duì)缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞缺氧鈣離子超載以及細(xì)胞損傷、凋亡的影響。2.建立體外H9C2心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型，在細(xì)胞水平上研究白藜蘆醇對(duì)缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞鈣離子超載的保護(hù)效應(yīng)的潛在機(jī)制。3.對(duì)細(xì)胞信號(hào)通路進(jìn)行干預(yù)的同時(shí)，予白藜蘆醇處理細(xì)胞，觀察白藜蘆醇對(duì)細(xì)胞信號(hào)通路表達(dá)及胞漿內(nèi)鈣離子濃度的影響，

2、進(jìn)一步探討白藜蘆醇對(duì)心肌細(xì)胞鈣離子超載的作用機(jī)制，為細(xì)胞內(nèi)鈣超載的防治提供新的策略。
　　對(duì)象與方法:
　　第一部分實(shí)驗(yàn):我們首先培養(yǎng)了大鼠心肌H9C2細(xì)胞，建立體外細(xì)胞缺氧復(fù)氧模型，實(shí)驗(yàn)分為5組:正常對(duì)照組，缺氧/復(fù)氧組，缺氧/復(fù)氧細(xì)胞加不同濃度白藜蘆醇(5umol/l，25umol/l，100umol/l)后處理組，分別用倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，F(xiàn)luo-3孵育細(xì)胞后，用激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)各組細(xì)胞胞漿內(nèi)鈣離子

3、熒光強(qiáng)度，通過(guò)CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活性，檢測(cè)培養(yǎng)液中LDH活性評(píng)估細(xì)胞損傷情況，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，凋亡蛋白酶-3檢測(cè)試劑盒觀察凋亡蛋白酶-3活性。
　　第二部分實(shí)驗(yàn):離體培養(yǎng)大鼠心肌H9C2細(xì)胞，建立細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型，實(shí)驗(yàn)分為5組:正常對(duì)照組，缺氧/復(fù)氧組，缺氧/復(fù)氧細(xì)胞加不同濃度白藜蘆醇(5umol/l，25umol/l，100umol/l)后處理組，通過(guò)實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)分別檢測(cè)各組細(xì)胞Frizzled-2及W

4、nt5a的基因表達(dá)水平;通過(guò)免疫印跡法分別檢測(cè)各組細(xì)胞Frizzled-2及Wnt5a的蛋白表達(dá)水平。
　　第三部分實(shí)驗(yàn):首先合成Frizzled-2基因，以pEGFP-C1為載體，構(gòu)建pEGFP-C1-Frizzled-2質(zhì)粒，將pEGFP-C1-Frizzled-2質(zhì)粒結(jié)合Lipo2000轉(zhuǎn)染至H9C2細(xì)胞。并將實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分為3組:正常對(duì)照組，轉(zhuǎn)染細(xì)胞組，轉(zhuǎn)染加白藜蘆醇處理組，通過(guò)實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)分別檢測(cè)各組細(xì)胞中Frizz

5、led-2及Wnt5a的基因表達(dá)水平;通過(guò)免疫印跡法分別檢測(cè)各組細(xì)胞中Frizzled-2及Wnt5a的蛋白表達(dá)水平;Fluo-3孵育細(xì)胞后，用激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)各組細(xì)胞胞漿內(nèi)鈣離子熒光強(qiáng)度。
　　計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差顯示。采用SPSS13.0(Chicago，IL，USA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用單因素方差分析分析，方差齊性檢驗(yàn)方差齊時(shí)，采用F檢驗(yàn)，方差齊性檢驗(yàn)方差不齊時(shí)，采用近似F檢驗(yàn)(Welch法)，采用LSD方法進(jìn)行組間兩

6、兩比較統(tǒng)計(jì)（方差齊），方差不齊時(shí)采用Games-Howell法進(jìn)行兩兩之間的比較統(tǒng)計(jì)（方差不齊），p＜0.05作為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)果:
　　1.我們利用Caspase-3試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞的Caspase-3活性，與正常對(duì)照組比較，缺氧/復(fù)氧細(xì)胞Caspase-3活性顯著升高(P＜0.01)，對(duì)缺氧/復(fù)氧細(xì)胞予三種不同濃度(5，25，100umol/l)白藜蘆醇后處理，各組細(xì)胞Caspase-3活性較缺氧/復(fù)氧組均顯著

7、降低(P＜0.001)，（見(jiàn)圖1-6，表1-5）。
　　2.通過(guò)實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)對(duì)各組中Frizzled-2及Wnt5a基因表達(dá)進(jìn)行定量檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn):正常對(duì)照組比較，缺氧/復(fù)氧組心肌細(xì)胞Frizzled-2及Wnt5a基因表達(dá)水平分別升高5.876±0.180和3.468±0.180倍，F(xiàn)rizzled-2及Wnt5a表達(dá)較正常對(duì)照組均顯著增強(qiáng)(P＜0.01);對(duì)缺氧/復(fù)氧細(xì)胞予三種不同濃度(5，25，100umol/l)白

8、藜蘆醇后處理，后處理各組心肌細(xì)胞Frizzled-2基因表達(dá)水平分別較對(duì)照組升高4.238±0.118，2.550±0.187及2.263±0.117倍，與缺氧/復(fù)氧組比較，后處理各組Frizzled-2基因表達(dá)均顯著降低(P＜0.01);后處理各組心肌細(xì)胞Wnt5a基因表達(dá)水平較正常對(duì)照組分別升高2.398±0.092，1.993±0.153及1.627±0.116倍，與缺氧/復(fù)氧組比較，后處理各組Wnt5a基因表達(dá)均顯著降低(P＜0

9、.01);且白藜蘆醇后處理的三組中，隨著RES濃度增高，降低Frizzled-2及Wnt5a基因表達(dá)的趨勢(shì)越明顯，（見(jiàn)圖2-1，表2-1）。通過(guò)免疫印跡法對(duì)各組中Frizzled-2及Wnt5a蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn):正常對(duì)照組Frizzled-2及Wnt5a基因表達(dá)水平分別為0.203±0.017，0.407±0.025，缺氧/復(fù)氧組心肌細(xì)胞Frizzled-2及Wnt5a基因表達(dá)水平分別為1.142±0.072和0.915±0.

10、071，缺氧/復(fù)氧組心肌細(xì)胞Frizzled-2及Wnt5a蛋白表達(dá)較對(duì)照組均顯著增強(qiáng)(P＜0.001);對(duì)缺氧/復(fù)氧細(xì)胞予三種不同濃度(5，25，100umol/l)白藜蘆醇后處理，后處理各組心肌細(xì)胞Frizzled-2蛋白表達(dá)水平分別為0.829±0.023，0.505±0.037及0.402±0.026，與H/R組比較，各組Frizzled-2蛋白表達(dá)水平均顯著降低(P＜0.01);后處理各組心肌細(xì)胞Wnt5a蛋白表達(dá)水平分別為0

11、.707±0.050，0.601±0.037及0.556±0.039，與缺氧/復(fù)氧組比較，各組Wnt5a蛋白表達(dá)水平均顯著降低(P＜0.01);藥物后處理的三組中，隨著藥物濃度增高，有降低Frizzled-2及Wnt5a蛋白表達(dá)的趨勢(shì)，（見(jiàn)圖2-2，表2-2）。
　　3.我們首先合成Frizzled-2基因，以pEGFP-C1為載體，構(gòu)建pEGFP-C1-Frizzled-2質(zhì)粒，通過(guò)質(zhì)粒基因測(cè)序，證實(shí)了質(zhì)粒的基因序列與目的基因F

12、rizzled-2一致（如圖3-1所示），再將pEGFP-C1-Frizzled-2質(zhì)粒結(jié)合Lipo2000轉(zhuǎn)染至H9C2細(xì)胞。利用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)對(duì)各組中Frizzled-2及Wnt5a基因表達(dá)進(jìn)行定量檢測(cè)（如圖3-2，表3-1所示），結(jié)果發(fā)現(xiàn):與正常對(duì)照組比較，經(jīng)Frizzled-2全基因轉(zhuǎn)染后，心肌細(xì)胞Frizzled-2及Wnt5a基因表達(dá)水平分別升高6.798±0.311和3.003±0.217倍，F(xiàn)rizzled-2及W

13、nt5a基因表達(dá)水平較對(duì)照組均顯著增強(qiáng)(P＜0.01);對(duì)Frizzled-2基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞同時(shí)予10umol/l白藜蘆醇處理，白藜蘆醇處理組心肌細(xì)胞Frizzled-2及Wnt5a基因表達(dá)水平分別為對(duì)照組的4.040±0.249和1.844±0.197倍，與單純Frizzled-2基因轉(zhuǎn)染組比較，白藜蘆醇處理組細(xì)胞Frizzled-2及Wnt5a基因表達(dá)顯著降低(P＜0.01)。通過(guò)免疫印跡法對(duì)各組中Frizzled-2及Wnt5a蛋白

14、表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn):正常對(duì)照組Frizzled-2及Wnt5a蛋白表達(dá)水平分別為0.197±0.010，0.407±0.025，經(jīng)Frizzled-2全基因轉(zhuǎn)染后，心肌細(xì)胞Frizzled-2及Wnt5a蛋白表達(dá)水平分別為1.295±0.028和0.801±0.019，F(xiàn)rizzled-2及Wnt5a蛋白表達(dá)較對(duì)照組均顯著增強(qiáng)(P＜0.0l);轉(zhuǎn)染的同時(shí)對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞予10umol/l白藜蘆醇處理，白藜蘆醇處理組心肌細(xì)胞Frizzled

15、-2及Wnt5a蛋白表達(dá)水平分別為0.801±0.017，0.602±0.013，與單純轉(zhuǎn)染組比較，處理組心肌細(xì)胞Frizzled-2及Wnt5a蛋白表達(dá)均顯著降低(P＜0.01)，（見(jiàn)圖3-3，表3-2）。利用Fluo/3AM鈣離子特異性熒光染料孵育細(xì)胞，用激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)各組細(xì)胞胞漿內(nèi)鈣離子熒光強(qiáng)度（如圖3-4，表3-3所示），結(jié)果發(fā)現(xiàn):Frizzled-2基因轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞內(nèi)的鈣離子熒光強(qiáng)度（0.0288±0.0021）較正常對(duì)

16、照組細(xì)胞內(nèi)鈣離子熒光強(qiáng)度（0.0100±0.0008）顯著增強(qiáng)(P＜0.01)，白藜蘆醇處理組細(xì)胞內(nèi)鈣離子熒光強(qiáng)度為0.0182±0.0012，與單純轉(zhuǎn)染組比較，鈣離子熒光強(qiáng)度顯著降低，(P＜0.01)。
　　結(jié)論:
　　1.本研究通過(guò)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)H9C2心肌細(xì)胞損傷模擬心肌缺血再灌注損傷，采用不同濃度白藜蘆醇后處理干預(yù)缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞，結(jié)果表明結(jié)果表明白藜蘆醇不但在較低濃度下通過(guò)抑制缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞內(nèi)鈣超載，具有抗損

17、傷、抗凋亡的后適應(yīng)效應(yīng)，且在較大的濃度范圍內(nèi)(＜100umol/l)，RES后處理仍然具有顯著抑制H/R心肌細(xì)胞內(nèi)鈣超載及抗損傷、抗凋亡的后適應(yīng)作用。
　　2.通過(guò)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)H9C2心肌細(xì)胞損傷模擬心肌缺血再灌注損傷，采用不同濃度白藜蘆醇后處理干預(yù)缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞，結(jié)果表明Wnt5a及Frizzled-2在正常H9C2心肌細(xì)胞少量表達(dá)，并在缺氧/復(fù)氧損傷后表達(dá)顯著上調(diào);在一定的劑量范圍內(nèi)（5-100 umol/l，RES后處

18、理能從基因及蛋白水平顯著減少缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞Wnt5a及Frizzled-2的表達(dá)。
　　3.將包含F(xiàn)rizzled-2全基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至H9C2細(xì)胞，并對(duì)Frizzled-2基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞同時(shí)進(jìn)行白藜蘆醇處理，結(jié)果表明:經(jīng)白藜蘆醇的干預(yù)，可抑制Frizzled-2基因轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞內(nèi)上調(diào)的Frizzled-2和Wnt5a基因及蛋白的表達(dá)水平;并降低Frizzled-2基因轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞胞漿內(nèi)的鈣離子濃度，這可能是RES減輕缺氧/復(fù)氧