雷公藤紅素對H9C2心肌細胞缺氧復(fù)氧損傷的保護作用及其可能相關(guān)機制研究.pdf

1、目的：缺血性心臟病是目前威脅人類健康的常見疾病之一，且具有較高的致死率。當(dāng)心肌缺血發(fā)生后，及時對缺血心肌進行血液再灌注治療是目前減少心肌細胞壞死最有效的途徑，然而再灌注技術(shù)的應(yīng)用在挽救心肌的同時也造成了心肌的損傷，即心肌缺血再灌注損傷（Myocardial ischemia reperfusion injury, MIRI）。因此，如何有效的預(yù)防和減輕MIRI，成為了再灌注療法治療缺血性心臟病亟待解決的問題。目前，無論是在體實驗還是體外

2、實驗研究都表明MIRI的發(fā)生與多種機制有關(guān)。氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、離子通道異常、血小板激活引起微血栓形成、冠狀動脈內(nèi)功能紊亂等均參與了MIRI的發(fā)生。針對MIRI的治療國內(nèi)外學(xué)者相繼提出了缺血預(yù)適應(yīng)(ischemic preconditioning，IPC)和缺血后適應(yīng)（ischemic postconditioning，IPoC）療法，但鑒于在臨床實際工作中，二者實踐起來仍面臨著一定困難，操作復(fù)雜，且與醫(yī)學(xué)倫理學(xué)不符，因此尋找新的藥物預(yù)

3、防和減輕MIRI更為切合臨床。雷公藤紅素(celastrol)，來源于中藥雷公藤的根皮，為雷公藤的三萜單體成分。大量研究表明，雷公藤紅素具有多種藥理作用，包括抗氧化，抗炎癥，抗腫瘤以及調(diào)控肥胖的作用。近期一項研究指出，雷公藤紅素對大鼠腎臟缺血再灌注損傷具有保護作用，而雷公藤紅素對MIRI是否具有的保護仍然是未知的。因此我們設(shè)想:雷公藤紅素通過調(diào)節(jié)NF-κB的表達，緩解IL-1β、TNF-a炎癥因子介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，從而減輕MIRI。為了驗

4、證該假設(shè)，我們利用大鼠H9C2細胞行缺氧復(fù)氧，模擬MIRI模型，研究雷公藤紅素對MIRI的保護作用及其可能相關(guān)機制。
　　方法：⑴研究雷公藤紅素預(yù)處理對H9C2心肌細胞缺氧復(fù)氧損傷的影響。首先取對數(shù)生長期的細胞，實驗隨機分為7組:正常對照組(Control組)、缺氧復(fù)氧組(H/R組)，根據(jù)缺氧復(fù)氧的時間不同分為H4hR2h組、H6hR3h組、H8hR4h組、H12hR5h組、H16hR6h組、H20hR8h組;顯微鏡下觀察細胞狀態(tài)

5、，MTT檢測細胞活性，確定缺氧復(fù)氧模型;然后實驗隨機分為8組:正常對照組(Control組)、缺氧復(fù)氧組（H瓜組）、缺氧復(fù)氧+雷公藤紅素預(yù)處理組(H/R+Cel組)，根據(jù)雷公藤紅素不同分為Cel1(10nM)、Cel2(20nM)、Cel3(50nM)、Cel4(100nM)、Cel5(200nM)、Cel6(400nM)組，MTT檢測細胞活性，確定最佳藥物劑量組;利用最佳藥物劑量，將實驗隨機分為4組:正常對照組(Control組)、雷

6、公藤紅素預(yù)處理組(Celastrol組)、缺氧復(fù)氧組(H/R組)、缺氧復(fù)氧+雷公藤紅素預(yù)處理組(H/R+Celastrol組)。顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化，MTT測細胞活性，檢測LDH評估細胞損傷程度。⑵雷公藤紅素預(yù)處理對H9C2心肌細胞缺氧復(fù)氧損傷的保護作用的可能相關(guān)機制研究。實驗隨機分為4組:Control組、Celastrol組、H/R組、H/R+Celastrol組，Western blot檢測IL-1β、TNF-a、NF-κ B

7、蛋白表達情況，Realtime PCR檢測IL-1β、TNF-a、NF-κBmRNA的相對表達情況。⑶統(tǒng)計方法:獨立樣本t檢驗用于兩組間比較，多個樣本比較時采用單因素方差分析;P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果：①雷公藤紅素預(yù)處理對H9C2心肌細胞缺氧復(fù)氧損傷發(fā)揮保護作用。MTT結(jié)果顯示隨著缺氧時間延長，細胞活性降低。與Control組比H6hR3h細胞存活率為80.066±2.130％，H8hR4h的細胞存活率為69.

8、716±1.303％，為進行后續(xù)藥物干預(yù)實驗，選擇H8hR4h構(gòu)建細胞缺氧復(fù)氧模型。用不同劑量的雷公藤紅素(0nM、10nM、20nM、50nM、100nM、200nM、400nM)預(yù)處理細胞，1h后進行缺氧8h復(fù)氧4h處理;雷公藤紅素50nM細胞存活率最高為81.931±2.157％，選擇此濃度為最佳劑量。LDH測定結(jié)果顯示:與H/R組相比，H/R+Celastrol組細胞存活率升高，LDH釋放量顯著降低(P＜0.001)。②雷公藤紅

9、素預(yù)處理對H9C2心肌細胞缺氧復(fù)氧損傷的保護作用的可能相關(guān)機制研究。Realtime PCR及Western blot結(jié)果顯示H/R+Celastrol組與H/R組相比IL-1β、TNF-amRNA及蛋白表達降低(P＜0.05)。H/R+Celastrol組與H/R組相比發(fā)現(xiàn)，NF-κ BmRNA表達降低(P＜0.001)，胞漿內(nèi)NF-κβ蛋白表達增加（P=0.035），核內(nèi)NF-κβ蛋白表達降低(P=0.047)。
　　結(jié)論：低