番茄紅素對(duì)缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)H9C2心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的保護(hù)作用及其可能相關(guān)機(jī)制.pdf

1、目的：
　　心肌缺血再灌注損傷(MI/RI)是指心肌在較長(zhǎng)時(shí)間缺血后再恢復(fù)血供時(shí)心肌損傷反而加重的病理現(xiàn)象。近年來(lái)，有研究發(fā)現(xiàn)MI/RI能夠引起一系列的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激損傷，嚴(yán)重影響患者的健康，這已經(jīng)引起多數(shù)臨床醫(yī)生的關(guān)注。
　　番茄紅素是一種類(lèi)胡蘿卜素化合物，普遍富含于水果及蔬菜之中，是一種純天然抗氧化劑。它作用廣泛，例如，能夠提高抗氧化酶類(lèi)的活性;維持正常細(xì)胞代謝;調(diào)節(jié)血脂等。
　　目前研究已證實(shí)，缺氧復(fù)氧可引起

2、心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，致GRP78表達(dá)增加，通過(guò)激活CHOP、p-JNK、Capase-12表達(dá)增加，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的增加。而番茄紅素是否能通過(guò)抑制CHOP、p-JNK及Capase-12表達(dá)減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激從而對(duì)缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞起到保護(hù)作用尚不得知。
　　本文選用大鼠H9c2心肌細(xì)胞，行缺氧/復(fù)氧處理，制造缺氧/復(fù)氧模型，經(jīng)不同濃度的番茄紅素預(yù)處理產(chǎn)生心肌保護(hù)作用，明確最佳保護(hù)濃度的番茄紅素，用MTT檢測(cè)細(xì)胞存活率，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)

3、細(xì)胞凋亡比例，檢測(cè)GRP78、CHOP、JNK、p-JNK及Casepase-12mRNA及蛋白表達(dá)水平，加用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑4-苯基丁酸(4-phenylbutyric acid,4-PBA)及特異性激活劑毒胡蘿卜素內(nèi)酯(Thapsigargin，TG)，明確番茄紅素對(duì)H9C2心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧的保護(hù)作用與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的關(guān)系并探討番茄紅素發(fā)揮保護(hù)作用可能相關(guān)機(jī)制，為日后心肌缺血再灌注損傷的臨床治療提供新的思路。
　　方法：
　

4、　一、實(shí)驗(yàn)材料
　　H9C2心肌細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù);番茄紅素購(gòu)自大連美侖;毒胡蘿卜素、4-苯基丁酸鈉、MTT、DMSO購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco;RIPA裂解液、羊抗兔IgG-HRP二抗購(gòu)自碧云天;反轉(zhuǎn)錄酶、Taq PCR MasterMix購(gòu)自BioTeke公司;凋亡檢測(cè)試劑盒、GRP78、CHOP、p-JNK、JNK、β-actin兔抗鼠一抗購(gòu)自萬(wàn)類(lèi)生物，Caspase-12一抗購(gòu)自北京博奧

5、森;實(shí)驗(yàn)中所用其他試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。
　　二、實(shí)驗(yàn)方法
　?。ㄒ唬┓鸭t素對(duì)缺氧復(fù)氧H9C2心肌細(xì)胞的保護(hù)作用與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的關(guān)系
　　1.建立H9C2心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧模型
　　將H9C2心肌細(xì)胞隨機(jī)分為6組。(1)空白對(duì)照組;(2)缺氧4小時(shí)復(fù)氧0小時(shí);(3)缺氧4小時(shí)復(fù)氧2小時(shí);(4)缺氧4小時(shí)復(fù)氧4小時(shí);(5)缺氧4小時(shí)復(fù)氧6小時(shí);(6)缺氧4小時(shí)復(fù)氧8小時(shí)。置于三氣培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。通過(guò)MTT法檢測(cè)不

6、同組H9C2心肌細(xì)胞的生存率，確立最佳的復(fù)氧時(shí)間Mh，建立缺氧復(fù)氧模型。
　　2.篩選最佳保護(hù)作用的番茄紅素濃度
　　以第一部分基礎(chǔ)建立的缺氧復(fù)氧模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
　　此部分實(shí)驗(yàn)分8組:(1)空白對(duì)照組;(2)0μM番茄紅素預(yù)處理+H/R組(0μM番茄紅素孵育4h后缺氧4h復(fù)氧Mh);(3)1.25μM番茄紅素預(yù)處理+H/R組(1.25μM番茄紅素孵育4h后缺氧4h復(fù)氧Mh);(4)2.5μM番茄紅素預(yù)處理+H/R組（2

7、.5μM番茄紅素孵育4h后缺氧4h復(fù)氧Mh）;(5)5μM番茄紅素預(yù)處理+H/R組（5μM番茄紅素孵育4h后缺氧4h復(fù)氧Mh）;(6)10μM番茄紅素預(yù)處理+H/R組(10μM番茄紅素孵育4h后缺氧4h復(fù)氧Mh);(7)20μM番茄紅素預(yù)處理+H/R組(20μM番茄紅素孵育4h后缺氧4h復(fù)氧Mh);(8)球形脂聯(lián)素（globular adiponectin，gAd）預(yù)處理+H/R組（2μg/ml gAd培養(yǎng)1h后缺氧4h復(fù)氧Mh）。通過(guò)

8、MTT法檢測(cè)不同組H9C2心肌細(xì)胞的生存率，并與已驗(yàn)證具有保護(hù)作用的gAd組相比較，篩選出最佳保護(hù)作用的番茄紅素濃度為ⅩμM。
　　3.實(shí)驗(yàn)分為5組:(1)空白對(duì)照組;(2)番茄紅素組（ⅩμM番茄紅素孵育4h）;(3)H/R組（缺氧4h復(fù)氧Mh）;(4)番茄紅素+H/R組(ⅩμM番茄紅素孵育4h后缺氧4h復(fù)氧Mh);(5)gAd+H/R組(2μg/ml gAd孵育1h后缺氧4h復(fù)氧Mh)。光鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài);通過(guò)檢測(cè)各組H9C

9、2心肌細(xì)胞LDH活性、凋亡比例及GRP78表達(dá)水平，與已驗(yàn)證通過(guò)抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)揮保護(hù)作用的gAd組相比較明確番茄紅素對(duì)缺氧復(fù)氧H9C2心肌細(xì)胞保護(hù)作用與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的關(guān)系。
　?。ǘ┓鸭t素減輕缺氧復(fù)氧致H9C2心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)揮保護(hù)作用的相關(guān)機(jī)制
　　該部分實(shí)驗(yàn)分為7組:(1)空白對(duì)照組;(2)番茄紅素組（ⅩμM番茄紅素孵育4h）;(3) H/R組（缺氧4h復(fù)氧Mh）;(4)番茄紅素+H/R組(ⅩμM番茄紅素孵育4h

10、后缺氧4h復(fù)氧Mh);(5)4-PBA+H/R組(預(yù)先加1 mM4-PBA孵育24h后缺氧4h復(fù)氧Mh);(6) TG組（3μM毒胡蘿卜素孵育24 h）;(7)番茄紅素+TG組（預(yù)先加ⅩμM番茄紅素孵育4h，再加3μM毒胡蘿卜素孵育24 h）。MTT法檢測(cè)不同組H9C2心肌細(xì)胞的生存率，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組H9C2心肌細(xì)胞的凋亡比例，并進(jìn)一步應(yīng)用分子生物學(xué)的方法，從分子水平觀察番茄紅素對(duì)缺氧復(fù)氧H9C2心肌細(xì)胞GRP78，CHOP，JNK

11、，p-JNK及Caspase-12mRNA及蛋白的影響，探討番茄紅素對(duì)缺氧復(fù)氧致H9C2心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的保護(hù)作用相關(guān)機(jī)制。
　　三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行描述，兩組間均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);組間比較采用單因素方差分析(One-WayANOVA);多重比較采用LDS法，P＜0.01為差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　（一）明確番茄紅素對(duì)缺氧

12、復(fù)氧H9C2心肌細(xì)胞的保護(hù)作用與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的關(guān)系
　　1.建立H9C2心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧模型
　　MTT法檢測(cè)不同組H9C2心肌細(xì)胞的生存率，在缺氧4小時(shí)、不同復(fù)氧時(shí)間下的H9C2心肌細(xì)胞生存率與對(duì)照組相比，各組生存率分別為:51.237±5.975％，57.787±11.364％，76.573±10.794％，60.761±7.851％，59.242±7.712％，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，且缺氧4小時(shí)后復(fù)氧6小

13、時(shí)、8小時(shí)后生存率呈逐漸下降趨勢(shì)。經(jīng)分析缺氧4h復(fù)氧4h為最佳缺氧復(fù)氧時(shí)間，即H4hR4h為H9C2心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧模型。
　　2.篩選最佳保護(hù)作用的番茄紅素濃度
　　不同濃度的番茄紅素（0μM，1.25μM，2.5μM，5μM and20μM）處理H9C2心肌細(xì)胞，然后進(jìn)行缺氧4小時(shí)復(fù)氧4小時(shí)處理，MTT法測(cè)各組H9C2心肌細(xì)胞生存率分別為51.086±14.386％,57.481±14.974％,64.445±11.94

14、2％,73.458±20.114％,84.192±12.490％，71.506±8.435％，與已證實(shí)有保護(hù)作用的gAd組(77.620±8.714％)相比，10μM番茄紅素具有最佳的保護(hù)作用。
　　光鏡下觀察各組細(xì)胞的形態(tài)，可見(jiàn)H9C2心肌細(xì)胞形態(tài)多樣，呈紡錘體形或多角形，折光性強(qiáng)。細(xì)胞伸出偽足，成簇生長(zhǎng)。與空白對(duì)照組相比，缺氧復(fù)氧組H9C2心肌細(xì)胞細(xì)胞偽足縮短或消失，折光性下降。而番茄紅素預(yù)處理后能夠減輕缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的細(xì)胞形態(tài)

15、改變。檢測(cè)各組H9C2心肌細(xì)胞LDH活性、凋亡比例及GRP78表達(dá)水平，與已證實(shí)可通過(guò)抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)揮保護(hù)作用的gAd組相比較，缺氧復(fù)氧組LDH活性、H9C2心肌細(xì)胞凋亡比例及GRP78蛋白表達(dá)水平明顯增加(P＜0.01)，而番茄紅素能明顯降低缺氧復(fù)氧導(dǎo)致的LDH活性、細(xì)胞凋亡比例及GRP78表達(dá)增加(P＜0.01)，并與gAd+缺氧復(fù)氧組相比差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　?。ǘ┓鸭t素減輕缺氧復(fù)氧致H9C2心肌細(xì)

16、胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)揮保護(hù)作用的相關(guān)機(jī)制
　　檢測(cè)不同組H9C2心肌細(xì)胞的生存率及凋亡比例，測(cè)定各組細(xì)胞GRP78，CHOP，JNK，p-JNK及Caspase-12mRNA及蛋白的表達(dá)水平。與對(duì)照組相比，缺氧復(fù)氧組及TG組細(xì)胞生存率明顯下降(P＜0.01);與缺氧復(fù)氧組相比，番茄紅素+缺氧復(fù)氧組與4-PBA+缺氧復(fù)氧組細(xì)胞生存率明顯增高(P＜0.01);與TG組相比，番茄紅素+TG組細(xì)胞生存率明顯增高(P＜0.01);而番茄紅素+缺氧

17、復(fù)氧組與4-PBA+缺氧復(fù)氧組細(xì)胞生存率差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。與對(duì)照組相比，缺氧復(fù)氧組及TG組的細(xì)胞凋亡比例及GRP78、CHOP和Caspase-12mRNA表達(dá)量、GRP78、CHOP、p-JNK和Caspase-12蛋白表達(dá)量明顯增加(P＜0.01);與缺氧復(fù)氧組相比，上述指標(biāo)在番茄紅素+缺氧復(fù)氧組與4-PBA+缺氧復(fù)氧組明顯下降(P＜0.01);與TG組相比，在番茄紅素+TG組也明顯下降(P＜0.01);而番茄紅

18、素+缺氧復(fù)氧組與4-PBA+缺氧復(fù)氧組相比差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。分析各組JNK mRNA及蛋白表達(dá)，結(jié)果示JNK mRNA及蛋白總量表達(dá)未見(jiàn)明顯變化，各組差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　結(jié)論：
　　（一）番茄紅素可以通過(guò)減輕缺氧復(fù)氧致H9C2心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激而發(fā)揮保護(hù)作用。
　?。ǘ┓鸭t素通過(guò)抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激致凋亡的關(guān)鍵信號(hào)通路CHOP、p-JNK和Caspase-12的表達(dá)對(duì)缺氧復(fù)氧H