ERK抑制劑提高結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)雷替曲塞敏感性及其機(jī)制的研究.pdf

1、目的：
　　本研究通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探討ERK抑制劑PD98059是否提高結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29對(duì)RTX（雷替曲塞）的敏感性，并對(duì)其中的相關(guān)作用特點(diǎn)及機(jī)制進(jìn)行深入研究，為結(jié)腸癌的臨床治療提供可靠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持。
　　方法：
　　1、培養(yǎng)人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29，待培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期時(shí)進(jìn)行傳代種板，細(xì)胞貼壁后按不同處理因素進(jìn)行分組：對(duì)照組、單純RTX組、單純PD98059組及聯(lián)合用藥組。
　　2、各處理組細(xì)胞在作用24h后

2、于普通光學(xué)倒置顯微鏡下觀察各組的細(xì)胞生長狀態(tài)及形態(tài)學(xué)改變。
　　3、使用MTT法及細(xì)胞計(jì)數(shù)法分別檢測各實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞被處理24h后的細(xì)胞增殖活力。
　　4、采用流式細(xì)胞儀法檢測被處理24h后的各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的凋亡率是否出現(xiàn)差異。
　　5、各試驗(yàn)組細(xì)胞被處理8h后，將每組的細(xì)胞總蛋白提取，使用western blot法檢測各組細(xì)胞中Ras、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白的相對(duì)表達(dá)量。
　　6、在無菌無酶狀態(tài)下提取出

3、各試驗(yàn)組細(xì)胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到K-Ras、ERK1、ERK2基因的cDNA后，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測各組相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量。
　　結(jié)果：
　　1、倒置顯微鏡下觀察可見與對(duì)照組相比，單純PD98059組形態(tài)及數(shù)量變化不明顯，而單純RTX組與聯(lián)合用藥組細(xì)胞數(shù)量均明顯減少，并可見核碎裂、凋亡小體等典型細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)變化，且聯(lián)合用藥組的細(xì)胞數(shù)量及形態(tài)學(xué)變化程度比其他各組更明顯。
　　2、MTT法及細(xì)胞計(jì)數(shù)法結(jié)果發(fā)現(xiàn)

4、相比于對(duì)照組，單純PD98059組細(xì)胞增殖率未出現(xiàn)明顯變化，而單純RTX組與聯(lián)合用藥組的細(xì)胞增殖活力均降低，且聯(lián)合用藥組的細(xì)胞增殖率的降低程度最深。
　　3、流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率變化方面，可見與對(duì)照組相比各實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞凋亡率均明顯升高，且聯(lián)合用藥組的細(xì)胞凋亡趨勢最顯著。
　　4、western blot法檢測細(xì)胞相關(guān)蛋白的表達(dá)量時(shí)可見與對(duì)照組相比，單純PD98059組細(xì)胞的Ras、ERK1/2蛋白表達(dá)無明顯變化，p-ER

5、K1/2蛋白表達(dá)下調(diào)；單純RTX組細(xì)胞的ERK1/2、Ras、p-ERK1/2蛋白表達(dá)無明顯差異；聯(lián)合用藥組細(xì)胞的Ras、ERK1/2蛋白表達(dá)均無明顯變化，p-ERK1/2蛋白表達(dá)均下調(diào)。
　　5、RT-PCR結(jié)果表示各實(shí)驗(yàn)組相比于對(duì)照組在ERK1、ERK2、K-Ras mRNA的表達(dá)上均未表現(xiàn)出明顯的差異（即P>0.05）。
　　結(jié)論：
　　1、RTX對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29具有抑制增殖及促進(jìn)凋亡作用。
　　2、