ERK抑制劑提高結腸癌細胞對雷替曲塞敏感性及其機制的研究.pdf

1、目的：
　　本研究通過體外細胞實驗探討ERK抑制劑PD98059是否提高結腸癌細胞HT-29對RTX（雷替曲塞）的敏感性，并對其中的相關作用特點及機制進行深入研究，為結腸癌的臨床治療提供可靠的實驗數(shù)據支持。
　　方法：
　　1、培養(yǎng)人結腸癌細胞HT-29，待培養(yǎng)至對數(shù)生長期時進行傳代種板，細胞貼壁后按不同處理因素進行分組：對照組、單純RTX組、單純PD98059組及聯(lián)合用藥組。
　　2、各處理組細胞在作用24h后

2、于普通光學倒置顯微鏡下觀察各組的細胞生長狀態(tài)及形態(tài)學改變。
　　3、使用MTT法及細胞計數(shù)法分別檢測各實驗組的細胞被處理24h后的細胞增殖活力。
　　4、采用流式細胞儀法檢測被處理24h后的各實驗組細胞的凋亡率是否出現(xiàn)差異。
　　5、各試驗組細胞被處理8h后，將每組的細胞總蛋白提取，使用western blot法檢測各組細胞中Ras、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白的相對表達量。
　　6、在無菌無酶狀態(tài)下提取出

3、各試驗組細胞的總RNA，反轉錄得到K-Ras、ERK1、ERK2基因的cDNA后，通過實時熒光定量PCR法檢測各組相關基因的相對表達量。
　　結果：
　　1、倒置顯微鏡下觀察可見與對照組相比，單純PD98059組形態(tài)及數(shù)量變化不明顯，而單純RTX組與聯(lián)合用藥組細胞數(shù)量均明顯減少，并可見核碎裂、凋亡小體等典型細胞凋亡形態(tài)學變化，且聯(lián)合用藥組的細胞數(shù)量及形態(tài)學變化程度比其他各組更明顯。
　　2、MTT法及細胞計數(shù)法結果發(fā)現(xiàn)

4、相比于對照組，單純PD98059組細胞增殖率未出現(xiàn)明顯變化，而單純RTX組與聯(lián)合用藥組的細胞增殖活力均降低，且聯(lián)合用藥組的細胞增殖率的降低程度最深。
　　3、流式細胞儀檢測細胞凋亡率變化方面，可見與對照組相比各實驗組的細胞凋亡率均明顯升高，且聯(lián)合用藥組的細胞凋亡趨勢最顯著。
　　4、western blot法檢測細胞相關蛋白的表達量時可見與對照組相比，單純PD98059組細胞的Ras、ERK1/2蛋白表達無明顯變化，p-ER

5、K1/2蛋白表達下調；單純RTX組細胞的ERK1/2、Ras、p-ERK1/2蛋白表達無明顯差異；聯(lián)合用藥組細胞的Ras、ERK1/2蛋白表達均無明顯變化，p-ERK1/2蛋白表達均下調。
　　5、RT-PCR結果表示各實驗組相比于對照組在ERK1、ERK2、K-Ras mRNA的表達上均未表現(xiàn)出明顯的差異（即P>0.05）。
　　結論：
　　1、RTX對結腸癌細胞HT-29具有抑制增殖及促進凋亡作用。
　　2、